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专利号: 2018108069747
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体在提高二元酸产量中的应用,所述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤如下:

(1)制备热带假丝酵母的感受态细胞;

(2)将上述基于CRISPR-Cas9的热带假丝酵母基因组无痕编辑的载体与步骤(1)制得的感受态细胞混合均匀后,进行电转化,制得转化细胞;

(3)将转化细胞复苏培养后,在含G418浓度800~1000μg/mL的固体YPD培养基上进行筛选培养,筛选抗G418的菌株;

(4)将步骤(3)制得的抗G418的菌株在含有5~15g/L半乳糖的筛选培养基筛选培养,制得编辑后的细胞;

(5)将步骤(4)制得的编辑后的细胞在发酵培养基中进行发酵培养6~8d,经分离、纯化,制得二元酸。

3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中的热带假丝酵母为热带假丝酵母(Candida tropicalis)CICC1798。

4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,制备热带假丝酵母的感受态细胞的具体步骤如下:取热带假丝酵母单菌落,培养至菌体浓度OD600为1.0~1.8,置于冰上冷却,离心,用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3~5次,电转缓冲液重悬菌体,制得热带假丝酵母感受态细胞。

5.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,电转化条件为:1300~

1800V、5~10ms连续点击2~3次。

6.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中,复苏培养条件为:28~32℃、

150~200r/min摇床复苏培养40~80min。

7.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中,复苏培养的复苏培养基组份为浓度1mol/L的山梨醇溶液。

8.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中,筛选培养条件为:28~32℃培养1~2天;

固体YPD培养基组分如下:葡萄糖2g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L,琼脂2g/L。

9.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)中,筛选培养条件为:28~32℃、培养24~72h;

筛选培养基组分如下:半乳糖100g/L、蛋白胨2g/L、酵母浸粉1g/L。

10.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(5)中,发酵培养基组份如下:葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 1g/L、酵母膏2g/L、VB1 0.1g/L、NaCl 2g/L、KH2PO4 4g/L、Na2HPO4·12H2O 10.08g/L、尿素2g/L、Mg2SO4·7H2O 6.15g/L、癸烷10%按体积百分比计,水配制,pH 7.0。