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专利号: 2018105409802
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种来源于假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)的转氨酶,其特征在于所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

2.一种权利要求1所述转氨酶的编码基因,其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

3.一种权利要求2所述转氨酶的编码基因构建的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述转氨酶在催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸合成L-草铵膦中的应用。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述的应用以含转氨酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂,以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸为底物,以磷酸吡哆醛为辅酶,加入氨基供体,于pH值为6~9的缓冲液中构成转化体系,在30~50℃、600rpm条件下反应,反应完全,将反应液分离纯化,获得L-草铵膦;所述氨基供体为L-谷氨酸、L-天冬氨酸或L-丙氨酸;所述转化体系中,催化剂的用量以湿菌体重量计为20~60g/L,所述底物的初始浓度为20~100mM,所述辅酶的用量为0.02~2mM,所述氨基供体用量为10~80mM。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含有转氨酶基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基,37℃、200rpm下培养

9h,再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中,于37℃、150rpm下培养至菌体OD600达0.6~0.8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,28℃下诱导培养12h后,4℃、8000rpm离心10min,弃去上清液,收集湿菌体。

7.一种权利要求1所述转氨酶突变体,其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO:2所示氨基酸第62位的异亮氨酸取代为缬氨酸、第74位的丝氨酸取代为苏氨酸、第93位的甲硫氨酸取代为异亮氨酸、第167位的酪氨酸取代为苯丙氨酸、第220位的丙氨酸取代为脯氨酸、第

282位的精氨酸取代为赖氨酸、第353位的丙氨酸取代为丝氨酸、第355的异亮氨酸取代为缬氨酸。

8.一种权利要求7所述转氨酶突变体编码基因,其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

9.一种权利要求7所述转氨酶突变体在催化2-羰基-4-(羟基甲基磷酰基)-丁酸合成L-草铵膦中的应用。

10.如权利要求9所述的应用,其特征在于所述的应用以含转氨酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂,以2-羰基-4-(羟基甲基磷酰基)-丁酸为底物,以磷酸吡哆醛为辅酶,加入氨基供体,于pH值为6~9的缓冲液中构成转化体系,在30~50℃、

600rpm条件下反应,反应完全,将反应液分离纯化,获得L-草铵膦;所述氨基供体为L-谷氨酸、L-天冬氨酸或L-丙氨酸;所述转化体系中,催化剂的用量以湿菌体重量计为20~100g/L,所述底物的初始浓度为10~500mM,所述辅酶的用量为0.02~25mM,所述氨基供体用量为

10~1750mM。