1.一种分离人体肠道样品中发酵乳杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）富集培养：取0.1 0.5g肠道内容物，在无菌条件下加入至培养基中，35℃ 37℃厌氧~ ~

条件下富集培养18 24h；所述培养基为：每L按照重量计包含如下成分：蛋白胨 8 15 g，牛~ ~

肉膏 8 15 g，酵母粉 3 10 g，吐温80 1 3 g，磷酸氢二钾 2 3 g，乙酸钠 2 5 g，柠檬酸二~ ~ ~ ~ ~

铵 1 3 g，七水硫酸镁 0.4 0.6 g，一水硫酸锰 0.15 0.25 g，阿拉伯糖 8 20 g，万古霉素 ~ ~ ~ ~

‑3  ‑2 

15 25×10 g，链霉素0.2 0.3g，庆大霉素6 8×10 g，L‑半胱氨酸 0.4 0.8 g；

~ ~ ~ ~

（2）梯度稀释：步骤（1）液体管振荡器振荡混匀，取1mL混悬液置于9mL生理盐水中，充分‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6混匀，得到10 稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10 、10 、10 、10 、10 稀释液；

‑4 ‑5 ‑6

（3）涂布培养：分别吸取100μL上述10 、10 、10 三个梯度稀释液于添加琼脂10 20 g~

的培养基上，用涂布棒涂布均匀，至37℃厌氧条件下培养48 h；

（4）一级纯化培养：取菌落数在30‑300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个形态大小各异的单菌落在MRS固体平板上划线，放至37℃厌氧条件下培养48h；

（5）二级纯化培养：取步骤（4）划线平板上单菌落接液体MRS管，至37℃厌氧条件下培养

20 h；

（6）菌种保存：将二级纯化培养菌悬液与灭菌60%甘油以1:1比例混合均匀，最终甘油浓度为30%，将混合液分装在冻存管中，冷冻保藏于‑80℃超低温冰箱；

（7）菌种鉴定：取步骤（6）剩余菌悬液离心获取菌泥，菌泥用无菌生理盐水重悬清洗后用于16S DNA PCR扩增，扩增序列送测鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中，每1L含有抗生素的质量为：‑3 ‑2

万古霉素20×10 g；链霉素0.256 g；庆大霉素6.4×10 g。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，制备上述培养基的方法包括如下步骤：（1）称取蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氢二钾2.6 g，乙酸钠2 g，柠檬酸氢二铵2 g，七水硫酸镁0.5 g，一水硫酸锰0.25 g，阿拉伯糖20 g，L‑半胱氨酸0.5 g加蒸馏水定容到969 mL，用HCL调pH至5.0±0.1，110 115℃灭菌15 20分钟；

~ ~

（2）配制浓度为2mg/mL的万古霉素溶液；配制浓度为6.4mg/mL庆大霉素溶液；配制浓度为25.6mg/mL的链霉素溶液；将上述溶液分别过滤膜灭菌；

（3）将步骤1灭菌后的混合物冷却至50 55℃，加入步骤2中溶液各10mL，混合均匀。

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4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，制备上述培养基的方法包括如下步骤：（1）称取蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氢二钾2.6 g，乙酸钠2 g，柠檬酸氢二铵2 g，七水硫酸镁0.5 g，一水硫酸锰0.25 g，阿拉伯糖20 g，L‑半胱氨酸0.5 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容到969 mL，用HCL调pH至5.0±0.1，110 115℃灭菌15 20分钟；

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（2）配制浓度为2mg/mL的万古霉素溶液；配制浓度为6.4mg/mL庆大霉素溶液；配制浓度为25.6mg/mL的链霉素溶液；将上述溶液分别过滤膜灭菌；

（3）将步骤1灭菌后的混合物冷却至50 55℃，加入步骤2中溶液各10mL，混合均匀。

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5.权利要求1 4任一所述方法在分离、鉴定发酵乳杆菌方面的应用。

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