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专利号: 2018101181021
申请人: 皖南医学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于观察小鼠精母细胞减数分裂过程中染色体形态变化的染色体铺展的方法,其特征在于,包括以下步骤:将已处死小鼠的睾丸破碎处理后并过滤离心后,以NaCl溶液作为低渗液;以多聚甲醛和十二烷基硫酸钠的PBS混合液作为固定液将小鼠精母细胞固定于玻片上;然后以小鼠SYCP3单克隆抗体为一抗,Dylight 549荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗为二抗,采用激光共聚焦显微镜观察小鼠精母细胞染色体铺展情况并记录分裂相。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述NaCl溶液的质量浓度为0.2 0.75%。

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3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述多聚甲醛和十二烷基硫酸钠的PBS混合液中的多聚甲醛的质量浓度为1 4%;十二烷基硫酸钠的质量浓度为0.01 0.5%。

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4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:将已处死小鼠的睾丸破碎处理后,利用巴氏吸管反复吹打,所得溶液过滤、离心;

S2:弃去离心液得到沉淀细胞,沉淀细胞中加入3 5mL PBS溶液,利用巴氏吸管重新悬~浮沉淀细胞,然后离心;

S3:弃去上清液得到沉淀细胞,向沉淀细胞中加入2 4mL质量浓度为0.2 0.75% NaCl溶~ ~液,重悬细胞,并静置5 20分钟;

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S4:利用巴氏吸管打匀细胞悬液,吸10 100μL悬液滴加载玻片上,用另一张玻片反复折~回两次,晾干;

S5:将晾干的玻片放入含有质量浓度为1 4%多聚甲醛和质量浓度为0.01 0.5%十二烷~ ~基硫酸钠的PBS混合液中2 20分钟;

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S6:将玻片再次放入含有质量浓度为1 4%多聚甲醛的PBS溶液中1 10分钟;

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S7:将玻片放入Photo Flo200溶液中3-5分钟,取出晾干;

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S8:向玻片上滴加50 100μL封闭液,室温封闭1 2小时;

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S9:弃封闭液,滴加稀释的小鼠SYCP3单克隆抗体作为一抗,37℃烘箱中孵育1 2小时;

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S10:弃一抗,利用PBS清洗3遍,滴加稀释的Dylight 549荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗作为二抗,37℃烘箱中孵育1小时;

S11:弃二抗,利用PBS清洗3遍,载玻片中央加1 2滴抗荧光淬灭剂,加盖盖玻片封片;

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S12:利用激光共聚焦显微镜,在激发波长549nm下,观察并记录分裂相即可。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S1中,利用孔径大小为100 250目~的滤网过滤。

6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S1和S2中,离心的参数为600~

1200转/分钟,离心5 15分钟。

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7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S7中,Photo Flo200溶液的质量~浓度为0.01 1%。

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8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S8中,封闭液为质量浓度为1 5%~BSA溶液。

9.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S9具体包括以下步骤:弃封闭液,滴加1:50 1:500稀释的小鼠SYCP3单克隆抗体50 100μL作为一抗,37℃烘箱中孵育1 2小~ ~ ~时。

10.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤S10具体包括以下步骤:弃一抗,利用PBS清洗3遍,滴加 1:500 1:1000稀释的Dylight 549荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗~

50 100μL作为二抗,37℃烘箱中孵育1小时。

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