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专利号: 2017108665952
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法,包括如下步骤:

1)根据TAO氧化酶的基因序列以及pET-22b(+)质粒信息设计引物,以来自于假单胞菌全基因组为模板扩增目标基因;设计的引物分别为:上游引物taoF:5’-CGCGAATTCGATGGAGGACATCATGCAAGGC-3’;(EcoR Ⅰ)下游引物taoD:5’-GCGGCGGCCGCTCAGTTAGTCCTCAAGTCGGAATTG-3’(Not Ⅰ)经PCR扩增获得TAO氧化酶基因;

2)将步骤1)中的PCR扩增产物以及pET-22b(+)质粒采用快切酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ同时进行双酶切,并纯化回收;将酶切的PCR产物和pET-22b(+)使用T4连接酶15-20℃过夜连接,获得重组质粒pET-22b(+)-tao;

3)将步骤2)中的重组质粒转入到E.coli BL21(DE3),获得重组菌E.coli BL21(DE3)(tao):将重组质粒加入至E.coli BL21(DE3)感受态中,冰下放置10-40min,并将其在40-45℃水浴中热击60-120s,冰中冷却1-5min,加入0.5-2mL的LB培养基,于30-40℃培养0.5-3h后涂布获得重组菌株E.coli BL21(DE3)(tao);

4)重组菌株合成胡椒醛:将步骤3)中的重组菌株E.coli BL21(DE3)(tao)培养生长到OD600为0.6~3时,以0.05~1.0mmol/L IPTG在15~35℃下诱导培养2~10h,收集菌体;将重组菌悬于pH为3~11的缓冲液中,添加1~20g/L黄樟油素,在温度20~40℃,转速80-220rpm下反应0.5~12h。

2.如权利要求1所述的一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法,其特征在于:步骤

1)所述的PCR条件为94℃预变性3min,98℃变性10s,55℃退火5s,72℃延伸1min,72℃延伸

7min,其中第二阶段进行30个循环。

3.如权利要求1所述的一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法,其特征在于:步骤

4)中,所述的重组菌株合成胡椒醛步骤包括:OD600为1.25~2时,以0.05~0.1mmol/L IPTG在20~25℃下诱导培养6~8h。

4.一种重组大肠杆菌,其特征在于,向大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中导入带有黄素单加氧酶目的基因的重组质粒,构建重组菌株E.coli BL21(DE3)(tao),且该菌株能够催化黄樟油素合成胡椒醛。

5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌,其特征在于,其含有序列SEQ ID NO 1。

6.如权利要求4所述的重组大肠杆菌的应用,其用于以黄樟油素为底物合成胡椒醛的生产。

7.一种重组质粒,其序列为SEQ ID NO 1。