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专利号: 2017108665952
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法,包括如下步骤:

1)根据TAO氧化酶的基因序列以及pET-22b(+)质粒信息设计引物,以来自于假单胞菌(Pseudomonas)全基因组为模板扩增目标基因;设计的引物分别为:上游引物taoF:5’- CGCGAATTCGATGGAGGACATCATGCAAGGC-3’;

下游引物taoD:5’- GCGGCGGCCGCTCAGTTAGTCCTCAAGTCGGAATTG-3’经PCR扩增获得SEQ ID NO:1所示的TAO氧化酶基因;

2)将步骤1)中的PCR扩增产物以及pET-22b(+)质粒采用快切酶EcoR Ⅰ、Not Ⅰ同时进行双酶切,并纯化回收;将酶切的PCR产物和pET-22b(+)使用T4连接酶15-20℃过夜连接,获得重组质粒pET-22b(+)-tao;

3)将步骤2)中的重组质粒转入到E. coli BL21(DE3),获得重组菌E. coli BL21(DE3)(tao):将重组质粒加入至E. coli BL21(DE3)感受态中,冰下放置10-40 min,并将其在40-

45 ℃水浴中热击60-120 s,冰中冷却1-5 min,加入0.5-2 mL的LB培养基,于30-40 ℃培养

0.5-3 h后涂布获得重组菌株E. coli BL21(DE3)(tao);

4)重组菌株合成胡椒醛:将步骤3)中的重组菌株E. coli BL21(DE3)(tao) 培养生长到OD600为0.6 ~ 3时,以0.05 ~ 1.0 mmol/L IPTG在15 ~35 ℃下诱导培养2~10 h,收集菌体;将重组菌悬于pH为7   9的缓冲液中,添加10   20 g/L黄樟油素,在温度30   35 ℃,~ ~ ~转速80-220 rpm下反应5   7 h。

~

2.如权利要求1所述的一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法,其特征在于:步骤

1)所述的PCR条件为94 ℃预变性3 min;98 ℃变性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸1 min,

30个循环;72 ℃延伸7 min。

3.如权利要求1所述的一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法,其特征在于:步骤

4)中,所述的重组菌株合成胡椒醛步骤包括:OD600为1.25 ~ 2时,以0.05 ~ 0.1 mmol/L IPTG在20  25 ℃下诱导培养6 8 h。

~ ~

4.一种重组大肠杆菌的应用,其特征在于,所述重组大肠杆菌为:向大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中导入带有序列如SEQ ID NO:1的黄素单加氧酶目的基因的重组质粒,构建重组的菌株E. coli BL21(DE3)(tao),将所述重组菌株用于以黄樟油素为底物合成胡椒醛的生产。