1.一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)单细胞制备:取霍山石斛蒴果消毒后用固体培养基进行无菌播种,待萌发成原球茎后取出,采用酶解法分离制备单细胞,并离心过滤除杂,收集单细胞;
(2)单细胞系培养:将收集到的单细胞接种到第一MS液体培养基中培养;
(3)细胞群放大培养:将培养好的单细胞系接种于第二MS液体培养基中培养;所述第二MS液体培养基中的磷元素含量为MS液体培养基的2-3倍,所述第二MS液体培养基中还添加有1-2mg/L的锗元素、0.02-0.1mg/L硒元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白,pH值为5.8±
0.4;
(4)提取霍山石斛生物碱:当细胞密度达到60000-80000个/ml,降低培养温度至7-10℃,继续培养5-7天,采用离心收集霍山石斛细胞;再提取霍山石斛生物碱。
2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法,其特征在于,所述步骤(1)播种采用的培养基为适合兰科植物生长的固体培养基。
3.根据权利要求2所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法,其特征在于,所述固体培养基为1/2MS固体培养基。
4.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法,其特征在于,所述步骤(2)中单细胞接种量为25±2g/L,光强度为2000-4000lux,色温为4000-6000K,震荡培养,温度22±2℃,当细胞密度达到10000-20000个/mL,即可放大培养。
5.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法,其特征在于,所述步骤(3)中单细胞系接种量为30±2g/L,光强度为2000-4000lux,色温为4000-6000K,温度22±2℃,气升搅拌悬浮培养,调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%。
6.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法,其特征在于,所述第二液体MS培养基中还添加有0.1-2mg/L NAA、0.1-2mg/L6-BA、50-100mg/L果胶酶、
10-50mg/L纤维素酶,pH值为5.8±0.4。
7.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法,其特征在于,所述锗元素来源于GeO2或有机锗。
8.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法,其特征在于,所述硒元素来源于Na2SeO3或有机硒。