1.虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)虾仁加工下脚料蛋白酶解物的制备:将虾仁加工下脚料用组织捣碎机粉碎,按照料液比1 g:4~5 mL加入磷酸盐缓冲液,于45~50℃下于超声功率400~500W下超声60~
90 min,然后加入中性蛋白酶,于45~50℃保温2~3 h后,温度升至90~95℃并保持
10~15 min;溶液温度降至37~40℃,pH调至 7.5~8.0,加入胰蛋白酶,保温2~3 h后,温度升至90~95℃并保持10~15 min后,于9 000 ~10 000g离心15~20 min,得上清液,即虾仁加工下脚料蛋白酶解物;所述的虾仁加工下脚料含有虾头或虾壳;所述的磷酸盐缓冲液为0.2 mol/L,pH 6.5~7.5;
2)虾仁加工下脚料锌螯合肽的制备:将制备的蛋白酶解物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3 kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液按照体积比加入到装有8~
10倍NKA-9大孔树脂的层析柱中,用2~3倍柱体积水洗脱除去杂质,然后用3~5倍柱体积的30%和60%乙醇进行洗脱,收集60%乙醇洗脱液,于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物,多肽混合物依次经固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化制备氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met、ESI/MS检测分子量为1027.20 Da的虾仁加工下脚料锌螯合肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是所述的反相高效液相色谱纯化制备具有如下步骤:①固定化锌离子层析柱层析: 将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶液,以0.5~1.5 mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱,分别用3~5柱体积的水和0.1 mol/L NaCl洗脱,收集0.1 mol/L NaCl洗脱组分,即为亲和层析组分;
②凝胶柱层析:将亲和层析组分溶于双蒸水配成浓度为10~20 mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据214 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物;
③RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55 μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化;
所述RP-HPLC条件为:进样量8~10 μL;色谱柱为Zorbax C18;流动相:15%乙腈;
洗脱速度0.5~0.8 mL/min;紫外检测波长220 nm;
根据对Zn的螯合活性得1个高Zn螯合活性胶原肽;
④结构检测:Zn螯合胶原肽经检测为单一峰,利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met,ESI/MS检测分子量为1027.20 Da。