1.一种马拉硫磷核酸适体在马拉硫磷检测分析中的应用,包括以下步骤:
1)、标靶溶液的预处理步骤为:
取待测蔬菜样品,擦去表面泥土后研碎,用含1%甲醇的1×SB缓冲液45℃提取15min;
称取1.0g碎片置于50mL烧杯中,加入10mL含1%甲醇的1×SB缓冲溶液,放入45℃的水浴锅中浸提15min;
2)、将马拉硫磷核酸适体与标靶溶液在避光室温下孵育20min,反应在1×SB缓冲溶液中进行,马拉硫磷核酸适体的最终浓度为0.1μmol/L;1×SB缓冲溶液中:Na+浓度为+ 2+
200mmol/L,K浓度为40mmol/L,Mg 浓度为10mmol/L,Tris浓度为50mmol/L,pH为8.0;
3)、加入分子信标并在避光室温下孵育60min,马拉硫磷核酸适体与分子信标的摩尔比为1:4,分子信标的最终浓度为0.4μmol/L;反应在1×SB缓冲溶液中进行,1×SB缓冲溶液中:Na+浓度为200mmol/L,K+浓度为40mmol/L,Mg2+浓度为10mmol/L,Tris浓度为50mmol/L,pH为8.0;
分子信标是含有20个碱基的单链DNA,分子信标的5′端和3′端被分别标记上了荧光基团与猝灭基团,分子信标与马拉硫磷核酸适体杂交的部位从核酸适体5′末端起第16个碱基至第30个碱基;
分子信标的序列如下所示:
CTGCACTTGAATCGCTGCAG
马拉硫磷核酸适体的序列如下所示:
TCTTGATCTGTAGTCCTGCAGCGATTCAAGACGGATACCCGTCACGCGGCTGC
4)、检测体系的荧光强度,并与空白对照组比较,计算荧光抑制率;
检测条件为激发波长为485nm,发射波长为535nm,荧光抑制率计算公式如下:R指荧光抑制率;F1指含有分子信标和核酸适体时的荧光值;F2指含有分子信标、核酸适体和马拉硫磷时的荧光值;M指仅含有分子信标时的荧光值。