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专利号: 2015100352857
申请人: 江苏发士达生物科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-06-25
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针,其特征在于:包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第65位、70位和151位突变位点K65R、K70E和Q151M的ARMS引物对和Taqman探针;

K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列,Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列,分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端;

K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列,Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列,分别用HEX和BHQ1标记5’端和3’端;

Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列,Taqman探针为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列,分别用ROX和BHQ1标记

5’端和3’端。

2.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针,其特征在于:包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第65位突变位点K65R的ARMS引物对和Taqman探针;

K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;

ARMS引物对的Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列,分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。

3.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针,其特征在于:包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第70位突变位点K70E的ARMS引物对和Taqman探针;

K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;

ARMS引物对的Taqman探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列,分别用HEX和BHQ1标记5’端和3’端。

4.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针,其特征在于:包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第151位突变位点Q151M 的ARMS引物对和Taqman探针;

Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列;

ARMS引物对的Taqman探针为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列,分别用ROX和BHQ1标记5’端和3’端。

5.权利要求1至4任一项所述的引物对和探针在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的应用。

6.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒,其特征在于:包括权利要求1至4任一项所述的ARMS引物对和探针。

7.根据权利要求5所述的用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒,其特征在于:还包括RT-PCR 混合液、混合酶液、阳性对照品混合液、阴性对照品混合液;所述RT-PCR 混合液包括RT-PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、3对上下游引物及3条探针;所述混合酶液包括M-MLV逆转录酶和Taq DNA聚合酶。

8.根据权利要求6所述的用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒,其特征在于,各组分含量分别为:RT-PCR混合液 875uL;

混合酶液 125 uL;

阳性质控品 45 uL;

阳性对照品混合液 45 uL;

阴性对照品混合液 45 uL。

9.根据权利要求7所述的用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒,其特征在于:所述RT-PCR 混合液包括:

RT-PCR 缓冲液(20mM Tris-Hcl, 100mM NaCl,pH8.3)终浓度1×;

dNTPs终浓度3mM;

MgCl2 终浓度为1.6mM;

各ARMS引物对的上、下游引物的终浓度均为200nM;各ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为300nM;

所述混合酶液包括:

M-MLV逆转录酶终浓度2U/μL;

TaqDNA聚合酶终浓度0.05U/μL;

所述阳性对照品混合液中模板cDNA终浓度 0.1~10ng/μL。

10.权利要求6至9任一项所述的试剂盒在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的应用,其特征在于:包括以下步骤:(1)总RNA提取:提取待测样本的RNA,提到模板RNA溶液;

(2)反应组分配制:分别配制检测混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物;其中,检测混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、模板RNA溶液5uL配制一人份;阳性对照品混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、阳性对照品混合液5uL配制一人份;

阴性对照品混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、阴性对照品混合液5uL配制一人份;

(3)扩增:分别将检测混合物、阳性质控品混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物放入荧光定量PCR仪扩增,按以下程度进行扩增:42℃,10min,1cycle;95℃,3 min,

1cycle;95℃,5S,55℃,40S,45cycles;

(4)结果判定:根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct值判定结果:当阳性质控品和阳性对照品的Ct值小于等于35,或者检测混合物为阳性时,试剂盒有效;当阳性质控品或阳性对照品的Ct值大于35,或者检测混合物无Ct值时,试剂盒无效或需重复检测。

11.如权利要求10所述的应用,其特征在于:步骤(4)中,根据检测混合物的Ct值定性判定,依据为:Ct>40时,待测样本中无HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变;35≤Ct≤40时,待测样本可疑,需重检一次,重检结果如Ct>40或无扩增曲线,则为待测样本中无HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变,反之则为待测样本中有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变;Ct﹤35时,待测样本中有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变产生。