1.一种转基因甜瓜组培苗的培育方法,其特征在于,步骤如下:
1)甜瓜转化受体的培育:将甜瓜种子去壳后,用70%酒精灭菌30s,再用0.05%升汞消毒10分钟,在超净工作台上用灭菌水洗3-4次,每次泡1分钟,选取100粒饱满的种子,在55-
60℃水中浸泡,用玻璃棒不断搅拌,至水温为室温后浸泡12h,将种子播到营养钵中,在光照强度2000Lx、日间温度25℃及夜间温度20℃的条件下,每日光照培养16h、每日黑暗培养8h,获得转化受体;
2)侵染液的准备:将含有CmACS-7的重组根癌农杆菌EHA105的单菌落用含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养液于28℃培养至OD600=0.8~1.2,然后在4000rpm下离心
10min,用200μmol/L的乙酰丁香酮液体培养基重悬至OD600为0.6,获得含有目的基因的重组农杆菌侵染液;
3)转化:对步骤1)所得转化受体进行剪切,在子叶未展开前,去除顶芽及侧芽,在子叶节分生组织处注射步骤2)所得含有目的基因的重组农杆菌侵染液;所述注射重组农杆菌侵染液是通过管状针头向步骤1)所得的转化受体的子叶节分生组织处注射40μL重组农杆菌的悬浮液,置于25℃、黑暗、湿度为90%的条件下进行暗培养两天,然后见光培养,第3天重复滴加1次;
4)芽诱导:诱导步骤3)中甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽,芽伸长生长获得侵染甜瓜幼苗;所述芽诱导是将pH5.7且含有1/2MS、1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.05%表面活性剂SILWET-77的诱导液滴加到步骤3)的注射处,促进茎尖不定芽的分化,直到甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽;
5)成苗培养及筛选:将培养的侵染甜瓜幼苗移栽至土壤中,在正常水肥条件下培养10天,长出新叶后,用100mg/L卡那霉素涂抹新叶,3天后,观察叶片是否变黄,野生型未转基因甜瓜的阴性植株的叶片变黄,转基因植株涂抹卡那霉素的叶片仍为绿色,去除叶片变黄的植株,保留叶片无变化的植株。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤2)所述含有目的基因的农杆菌,目的基因为CmACS-7,农杆菌为根癌农杆菌EHA105,筛选标记基因为,具有卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因NPT II;所述CmACS-7的引物序列如下:CmACS-7,5′-F TTCAACAAATCTTCAGTTCAATTTCTCTC 3′CmACS-7,5′-R AGAAAACAAGGATTTCTTTTTCTTTTTCCTCAG 3′npt II-F GACTGGGCACAACAGACAATC
npt II-R ATACCGTAAAGCACGAGGAAG。