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专利号: 2014103375165
申请人: 常熟理工学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-12-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种确定样品中双酚A浓度的方法,其特征在于,包括:(1)设计与合成生物素化修饰DNA及其互补DNA,并将其固定化至PCR反应容器的内表面,获得表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器;

(2)将含有双酚A的待测样品加入至所述表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器中,以便双酚A与互补DNA特异性结合;

(3)利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗,以便除去结合双酚A的互补DNA;

(4)向所述PCR反应容器中添加扩增引物,以便对未与双酚A特异性结合的互补DNA进行实时荧光定量PCR;以及(5)基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值,确定所述样品中的双酚A的浓度;

所述生物素化修饰DNA在5’端进行生物素化修饰,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;

所述互补DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;

所述引物组由下列引物构成:

上游引物的核苷酸如SEQ ID NO:3所示;

下游引物核苷酸如SEQ ID NO:4所示;

基于下列线性方程,确定所述样品中双酚A的浓度:

y=0.962x+6.02024,

y为所述实时荧光定量PCR的Ct 值,x为相应的双酚A浓度。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中,将生物素化修饰DNA及其互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括:用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理;

用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理;

向所述PCR反应容器中加入所述生物素化修饰DNA及其互补DNA,以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述生物素化修饰DNA及其互补DNA。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中,将生物素化修饰DNA及其互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括:用20微升0.8重量%的戊二醛溶液在37℃下对所述PCR反应容器进行处理5小时,并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗;

用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37℃下对所述PCR反应容器处理2小时,其中链霉亲和素在所述PCR容器中的终浓度为12.5 ng/mL,并用PBST溶液进行清洗,其中,所述PBST溶液含有10mM PBS,pH 7.2,0.05重量% Tween-20;

向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为100nM的所述生物素化修饰DNA及其互补DNA,在37℃下反应40分钟,并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗,其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mM NaCl,75mM C6H5Na3O7。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测样品中双酚A浓度不低于

0.8ng/mL。

5.根据权利要求1或3所述的方法,其特征在于,所述待测样品中双酚A浓度为1ng/mL~500 ng/mL。