1.一种确定样品中双酚A浓度的方法,其特征在于,包括:(1)设计与合成生物素化修饰DNA及其互补DNA,并将其固定化至PCR反应容器的内表面,获得表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器;
(2)将含有双酚A的待测样品加入至所述表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器中,以便双酚A与互补DNA特异性结合;
(3)利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗,以便除去结合双酚A的互补DNA;
(4)向所述PCR反应容器中添加扩增引物,以便对未与双酚A特异性结合的互补DNA进行实时荧光定量PCR;以及(5)基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值,确定所述样品中的双酚A的浓度;
所述生物素化修饰DNA在5’端进行生物素化修饰,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述互补DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;
所述引物组由下列引物构成:
上游引物的核苷酸如SEQ ID NO:3所示;
下游引物核苷酸如SEQ ID NO:4所示;
基于下列线性方程,确定所述样品中双酚A的浓度:
y=0.962x+6.02024,
y为所述实时荧光定量PCR的Ct 值,x为相应的双酚A浓度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中,将生物素化修饰DNA及其互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括:用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理;
用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理;
向所述PCR反应容器中加入所述生物素化修饰DNA及其互补DNA,以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述生物素化修饰DNA及其互补DNA。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中,将生物素化修饰DNA及其互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括:用20微升0.8重量%的戊二醛溶液在37℃下对所述PCR反应容器进行处理5小时,并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗;
用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37℃下对所述PCR反应容器处理2小时,其中链霉亲和素在所述PCR容器中的终浓度为12.5 ng/mL,并用PBST溶液进行清洗,其中,所述PBST溶液含有10mM PBS,pH 7.2,0.05重量% Tween-20;
向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为100nM的所述生物素化修饰DNA及其互补DNA,在37℃下反应40分钟,并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗,其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mM NaCl,75mM C6H5Na3O7。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测样品中双酚A浓度不低于
0.8ng/mL。
5.根据权利要求1或3所述的方法,其特征在于,所述待测样品中双酚A浓度为1ng/mL~500 ng/mL。