1.一种棒状杆菌表达载体,其特征在于,同时具有抗生素标记和alr基因这两种筛选标记。
2.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体是大肠杆菌-棒状杆菌穿梭表达载体,包括筛选标记、复制子片段、组成型启动子及多克隆位点;可回补宿主菌的alr缺陷,从而使载体可以在无抗生素添加情况下稳定存在于菌体中并行使表达功能。
4.一种棒状杆菌表达系统,其特征在于,通过质粒回补基因组alr基因缺陷,从而使表达载体在无抗生素添加情况下稳定存在于菌体中并行使表达功能,所述表达系统包括alr基因缺陷型表达宿主和权利要求1所述的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达系统,其特征在于,所述表达宿主是被敲除了编码丙氨酸消旋酶的基因alr的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
6.根据权利要求5所述的表达系统,其特征在于,所述表达宿主是将alr敲除载体转化入谷氨酸棒状杆菌,通过同源重组获得的alr缺陷型表达宿主,所述alr敲除载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.权利要求4所述表达系统的构建方法,其特征在于,主要步骤为:
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(1)用限制酶Bstz17I和SmaI双酶切载体pEC-XK99E,去除含lacI 基因及Ptrc启动子的DNA片段,将大片段自身环化,构建成的重组质粒大小5306bp,命名为pJYW-1;
(2)以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板,通过PCR扩增1598bp的alr基因及其原启动子,在片段两端分别引入BglII及PstI;PCR产物用BglII及PstI酶切,并连接到用BamHI及PstI酶切后的pJYW-1上,构建完成的质粒大小为6880bp,命名为pJYW-2;
(3)以MCS-F及MCS-R为引物,寡核苷酸链退火反应人工合成MCS片段,连入以AatII及PstI酶切后的pJYW-2,构建完成的质粒命名为pJYW-3,大小6942bp;AatII为上步与PstI一起引入的位点;
(4)分别以tac-F/tac-R及tacM-F/tacM-R以寡核苷酸链退火反应人工合成tac及tacM启动子片段,分别连入以AatII及NotI酶切的pJYW-3上,构建的重组质粒即为表达载体,分别命名为pJYW-4、pJYW-5;
(5)以C.glutamicumATCC13032基因组为模板,分别扩增各1000bp的alr基因上下游片段alr-U和alr-D;以pDTW-202为模板,扩增kan抗性基因片段;alr-U以XhoI、BamHI酶切,alr-D以XbaI及PstI酶切,kan片段以BamHI、XbaI酶切,三片段一起连入以XhoI及PstI酶切的pBluescriptIISK(+),构建完成的质粒即alr敲除载体,命名为pJYW-6;
(6)将alr敲除载体转化宿主菌,通过同源重组获得alr基因缺陷的宿主菌。
8.权利要求4所述表达系统的应用。
9.应用权利要求4所述表达系统表达缬氨酸合成途径基因ilvBNC,其特征在于,主要步骤为:(1)扩增ilvBNC基因片段,在两端分别引入NotI及HpaI酶切位点;将PCR产物片段以相应限制酶酶切后连入以同样限制酶酶切的表达载体,得到重组表达质粒;
(2)将重组表达质粒转入通过alr敲除载体敲除了alr基因的棒状杆菌,发酵产缬氨酸。