1.一种破坏烟曲霉生物膜的方法,包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、制备烟曲霉生物膜载体、药物对烟曲霉生物膜作用和结晶紫半定量,其特征在于,用金银花提取物的绿原酸破坏烟曲霉生物膜,具体步骤如下: 1)制备药物取400~500mg绿原酸用3~6ml 100%的二甲亚砜溶解,配制成浓度为102400 μ g/ml 的溶液,于-20°C ~_25°C储存; 2)收集菌株收集烟曲霉菌株,质控菌株为近平滑念珠菌; 3)制备载体将直径为1(T15 mm玻璃细胞爬片进行高温高压灭菌,作为载体; 4)制备孢子悬液将步骤2)收集的菌株接种到PDA培养皿,置于35~37°C生化培养箱进行复苏,后转至另一个PDA培养皿并置于35~37°C生化培养箱活化3飞天后,用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子,用2(T30ml MOPS缓冲的RPM1-1640重悬孢子,用血细胞计数板调整孢子浓度,并用RPM1-1640液体培养液调整浓度为f 3X IO6.孢子•ml-1,再用RPM1-1640液体培养基稀释50倍,得到2倍终浓度的孢子悬液; 5)药物敏感试验微量液基稀释法,在无菌的96孔细胞培养板的第I至第10孔加入步骤4)制备的孢子悬液,再将步骤I)制备的绿原酸置于无菌的96孔细胞培养板的第I至第10孔,第I孔加入量为100 μ 1,第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度,第11孔为步骤4)制备孢子悬液的生长对照孔, 第12孔为MOPS缓冲的RPM1-1640液体培养基,静置于35~37°C培养48h,获得绿原酸的最低抑菌浓度MIC ; 6)制备烟曲霉生物I吴 载体 A:早期模型建立将步骤2)收集的菌株接种到PDA培养皿,置于35~37°C培养箱培养活化3飞天,用5~IOml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子,用2(T25ml MOPS缓冲的RPM1-1640重悬孢子,用血细胞计数板调整孢子浓度,并用RPM1-1640液体培养液调整浓度为1~5X IO5.孢子.Hir1Jf f 2ml孢子悬液放在步骤3)制备的载体上,静置于35~37°C生化培养箱中培养;培养24h时载体上为早期烟曲霉生物膜; B:成熟期模型建立将步骤A制备的烟曲霉生物膜培养48h时载体上为成熟期烟曲霉生物膜; 7)药物对烟曲霉生物膜作用将步骤6)制备的两种模型烟曲霉生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗,后放入新的无菌载体中,按步骤5)获得的绿原酸最低抑菌浓度MIC,加入亚抑菌浓度的绿原酸,每个孔加入量为1ml,空白组为MOPS缓冲的RPM1-1640液体培养基,静置于35~37°C培养48飞0h,后取出载体,进行结晶紫半定量; 8)结晶紫半定量吸取步骤7)载体表面浮游菌液,室温干燥,取f2ml 1%结晶紫染色2(T30min,用磷酸盐缓冲液洗脱未结合的结晶紫,室温干燥,用f2ml 95%乙醇脱水3飞min,取100-110μ I洗脱液于96孔酶标板中,在波长为570nm处测各孔酶标值。
2.根据权利要求1所述的破坏烟曲霉生物膜的方法,其特征在于,所述步骤7)药物对烟曲霉生物膜作用,静置培养48飞Oh过程中,间隔24h用与原孔中相同药物换液。
3.根据权利要求1所述的破坏烟曲霉生物膜的方法,其特征在于,所述亚抑菌浓度的绿原酸浓度为128 μ g/ml~1024 μ g/ml。
4.根据权利要求1所述的破坏烟曲霉生物膜的方法,其特征在于,所述绿原酸为400^450mgo
5.根据权利要求1所述的破坏烟曲霉生物膜的方法,其特征在于,所述步骤5)加入药物的量为100 μ 1,静置 于35~36°C培养。