1.一种杀灭耐药烟曲霉的方法,其特征在于,包括制备药物、收集菌株、制备孢子悬液、药物敏感试验和联合药敏试验,具体检测步骤如下:
1)制备药物 将4~5mg两性霉素B和300~500mg肉桂醛,分别用3~5ml 100%的二甲亚砜溶解,并将溶液配成浓度为1280μg/ml和102400μg/ml,于-20~-25℃储存;
2)收集菌株 收集烟曲霉菌株,质控菌株为近平滑念珠菌;
3)制备孢子悬液 将步骤2)收集的菌株接种到PDA培养皿上,置于35~37℃生化培养箱进行复苏,后转至另一PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后,用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子,用20~30ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子,用血细胞计数板调整孢子浓度,并用RPMI-1640液体培养液调整浓度
6 -1
为1~3×10·孢子·ml ,再用RPMI-1640液体培养基稀释50倍,得到2倍终浓度的孢子悬液;
4)药物敏感试验 微量液基稀释法,将步骤1)制备的两性霉素B和肉桂醛分别置于无菌的2个96孔细胞培养板的第1至第10孔,第1孔加入量为100μl,第2~10孔依次以二倍稀释法至终浓度,再将步骤3)制备的孢子悬液加入滴1至第10孔,每孔加入量为1ml,第11孔为步骤3)制备孢子悬液的生长对照孔,第12孔为RPMI-1640液体培养基,静置于
35~37℃培养48h,分别获得两性霉素B和肉桂醛的最低抑菌浓度MIC;
5) 联合药物试验 在无菌96孔细胞培养板上加入两性霉素B和肉桂醛,前8列加入两性霉素B和肉桂醛,加入两性霉素B的浓度为1/32~4MIC,添加的量为50μl,加入肉桂醛的浓度为1/32~4MIC,添加的量为50μl,第9列为步骤3)制备孢子悬液的生长对照孔,第10列为无菌对照孔,再将步骤3)制备的孢子悬液加入到96孔板的第1~10列,每孔加入量为
100μl,后静置于35~37℃培养48~50h,观察。
2.根据权利要求1所述的杀灭耐药烟曲霉的方法,其特征在于,所述步骤5)含有两性霉素B和肉桂醛的96孔板预先制备好,保存在-20~-25℃下。
3.一种杀灭耐药烟曲霉的组合物,其特征在于,包括两性霉素B和肉桂醛,两性霉素B1/16-1/4MIC,肉桂醛1/32-1/4MIC。