1.一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将纤维堆囊菌菌株摇瓶培养72-96h,将得到的摇瓶菌种液接种至一级种子罐中一级放大培养72-96h,将得到的一级菌种液接种至二级种子罐中二级放大培养72-96h,将得到的二级菌种液转入发酵罐中三级放大发酵培养12-96h后,得到发酵液;
2)向发酵液中加入发酵液总体积1%~5%的大孔吸附树脂,调节pH值至7.0~7.4后,继续培养100-150h后,停止发酵;
3)收集步骤2)发酵结束后的液体中的大孔吸附树脂,用大孔吸附树脂3~5倍体积的乙酸乙酯进行洗脱,收集乙酸乙酯洗脱液,浓缩,得到含有埃博霉素B的粗提物;
4)将含有埃博霉素B的粗提物用甲醇溶解后,离心,将上清液经葡聚糖凝胶柱层析进行分离,用HPLC进行检测,合并含有埃博霉素B的组分,得到埃博霉素B分离液;
5)向埃博霉素B分离液中加入该分离液总体积2%~5%的分子印迹聚合物,摇床处理
18~30h后,用甲醇进行洗脱,收集甲醇洗脱液;
6)将甲醇洗脱液浓缩后,得到浓缩液,将浓缩液低温结晶处理,析出的白色结晶即为埃博霉素B。
2.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤1)所述的摇瓶、一级种子罐和二级种子罐中所用的培养基均为M26液体培养基,成分为:土豆淀粉7.5~8.0g/L,大豆蛋白胨1.5~2.0g/L,葡萄糖1.5~2.0g/L,
3+
酵母粉1.5~2.0g/L,MgSO4·7H2O1.0~1.2g/L,CaCl21.0~1.2g/L,EDTA-Fe 1mL/L,微量元素1mL/L,pH值为7.2;
所述的发酵罐中的培养基成分为:土豆淀粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆饼粉1.7~2.0g/L,MgSO4·7H2O2.3~2.5g/L,CaCl23.0~3.5g/L,
3+
EDTA-Fe 2mL/L,微量元素0.5~1.0mL/L,pH值为7.2。
3.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤1)所述的摇瓶中的培养温度为30℃,转速为180~220rpm;所述的一级种子罐、二级种子罐及发酵罐中的培养温度为30℃,转速为150~200rpm,空气流量比为2
1:0.5,罐压为0.04~0.1kg/cm ;步骤2)加入大孔吸附树脂后,转速调整至120~150rpm。
4.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤2)所述的大孔吸附树脂为XAD-16型大孔吸附树脂。
5.根据权利要求4所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤2)所述的大孔吸附树脂在使用前经过预处理,包括:先用3~5倍柱体积的甲醇浸泡大孔吸附树脂,摇床震荡12~24h后,去除甲醇,水洗至无醇味,再用甲醇浸泡
12~24h后,水洗至无醇味,备用。
6.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤3)所述的洗脱时间为18~32h,所述的浓缩是将乙酸乙酯洗脱液在40~
45℃下,真空度为-0.09~-0.085MPa的条件下,真空浓缩至干。
7.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤4)所述的葡聚糖凝胶柱层析选用Sephadex LH-20层析柱,流动相选用甲醇,上样量为柱体积的1%~2%,流动相流速为8~12mL/min,展开距离为7.2~7.8cm/h。
8.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤4)所述的离心是在15~25℃下,5000~10000rpm,离心10~20min。
9.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤5)所述的分子印迹聚合物是埃博霉素B分子印迹聚合物。
10.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤6)所述的浓缩是将甲醇洗脱液在40~45℃下,真空度为-0.09~-0.085MPa的条件下,真空浓缩至甲醇洗脱液体积的1/10;所述的低温结晶处理是将浓缩液在-20~-15℃下低温处理至析出白色结晶。