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专利号: 2013105985486
申请人: 华侨大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤一:取靛玉红15~20mg,溶解于150~200mL乙酸乙酯,使靛玉红浓度为0.1mg/mL;另取磷脂550~572mg,使靛玉红与磷脂摩尔比为1:10混合,60℃搅拌反应2.0h,反应完毕,除去乙酸乙酯,残余物用适量正己烷溶解后,离心后取上清液,将上清液转移至真空干燥器中减压干燥,所得紫红色半固体产物即为靛玉红磷脂复合物;

步骤二:取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、短刺小克银汉霉Cunninghamella blakesleana AS 3.970一支,置于25℃恒温培养箱中培养7天后,以适量无菌水将斜面上

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的孢子充分吹打下来,使单孢子悬液的浓度调整至10~10 个/mL,即得种子孢子液;

步骤三:以100ml,5mL的接种量,在土豆液体培养基上接种步骤二所得孢子液,在pH至

6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.1~4ug的接种量,加入各种不同比例的联合诱导子,继续培养12h后,再按1~10ug的接种量加入步骤一所得的靛玉红磷脂复合物,然后继续培养5天,每天检测各种靛玉红衍生物的含量和转化率,当产物转化率低至0.5~3%时,停止培养,过滤后收集菌丝体,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液;

步骤四:将步骤三提取液过滤,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,合并萃取液;而菌丝体则用与其重量比为1:3~1:10的乙酸乙酯超声提取30min,然后滤去菌丝体,所得滤液与萃取液合并,即得分离提取液;

步骤五:将经过步骤四处理所得的分离提取液,先用1mg:1~10mL的乙醇溶解后,采用硅胶拌样后蒸干,称取20倍于样品量的硅胶,使用湿法进行填柱和上样;首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净,再依次用以下6种洗脱液进行洗脱:体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、

5:2、1:1、1:3、1:5的二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、

1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,以及甲醇洗脱液;然后TLC控制收集主馏分,使用旋转蒸发仪将各个馏分溶液蒸干后,用适量甲醇溶解,再用0.22μm的滤膜过滤后,即得各种靛玉红衍生物分离液;

步骤六:将经过步骤五处理所得的各种靛玉红衍生物分离液,采用高效液相半制备法分离纯化,HPLC梯度洗脱法控制收集不同的靛玉红衍生物洗脱液,减压蒸去溶剂后,用甲醇结晶,即得靛玉红衍生物;

其中,步骤三中所用的联合诱导子采用下述9组物质中的任一组:

重量比为9:3:7的水杨酸、地塞米松以及β-环糊精;

重量比为15:4:7的硫代水杨酸、戊酸倍他米松以及2-羟丙基-β-环糊精;

重量比为5:3:2:5的茉莉酸甲酯、水杨酸、地塞米松以及2-羟丙基-β-环糊精;

重量比为10:3:2:9的茉莉酸甲酯、乙酰水杨酸、泼尼松龙以及2-羟丙基-β-环糊精;

重量比为8:6:2:7:1的茉莉酸甲酯、乙酰水杨酸、泼尼松龙、2-羟丙基-β-环糊精以及Ag+;

重量比为5:4:3:5:1的茉莉酸甲酯、5-磺基水杨酸、戊酸、2-羟丙基-β-环糊精以及Ag+;

重量比为6:3:1的茉莉酸甲酯、地塞米松以及羟乙基-β-环糊精;

重量比为6:3:1的乙酰水杨酸、地塞米松以及羟乙基-β-环糊精;

重量比为7:6:3:8的茉莉酸甲酯、磺基水杨酸、地塞米松以及2-羟丙基-β-环糊精。

2.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:所述土豆培养基为:土豆200g/L,葡萄糖20g/L;配置时将土豆去皮后将其切成小块,加水加热煮沸30min,过滤;取滤液定容至1L,加入葡萄糖20g,搅拌溶解后,121℃灭菌30min,即得;

所述斜面培养基为:取上述土豆培养基1L,加入琼脂粉各20g,加热溶解后分装于玻璃试管中,于121℃下灭菌30min后取出,倾斜45度,静置、冷却既得。

3.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:

TLC控制收集主馏分,用体积比为5:4:4的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯为展开剂;

所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为:色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm,粒径为5μm;吸收波长:292nm,流动相体积比:甲醇:水=75:25,流速:0.5ml/min、柱温:25℃、进样量100μl。

4.如权利要求1~3所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:所述方法可用于制备以下靛玉红衍生物:1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红;1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红;

1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红;1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红;1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红;5-羟基-靛玉红;5’-羟基-靛玉红;1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红。