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专利号: 2013105985486
申请人: 华侨大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤一:取靛玉红15~20mg,溶解于150~200mL乙酸乙酯,使靛玉红浓度为0.1mg/mL;另取磷脂550~572mg,使靛玉红与磷脂摩尔比为1:10混合,60℃搅拌反应2.0h,反应完毕,除去乙酸乙酯,残余物用适量正己烷溶解后,离心后取上清液,将上清液转移至真空干燥器中减压干燥,所得紫红色半固体产物即为靛玉红磷脂复合物;

步骤二:取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支,置于25℃恒温培养箱中培养7天后,以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来,使单孢子悬液的浓度调整至

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10 ~10 个/mL,既得种子孢子液;

步骤三:以100ml,5mL的接种量,在土豆液体培养基上接种步骤二所得孢子液,在pH至

6.0,温度30℃ ±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.1~4ug的接种量,加入各种不同比例的联合诱导子,继续培养12h后,再按1~10ug的接种量加入步骤一所得的靛玉红磷脂复合物,然后继续培养5天,每天检测各种靛玉红衍生物的含量和转化率,当产物转化率低至0.5~3%时,停止培养,过滤后收集菌丝体,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液;

步骤四:将步骤三提取液过滤,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,合并萃取液;而菌丝体则用与其重量比为1:3~1:10的乙酸乙酯超声提取30min,然后滤去菌丝体,所得滤液与萃取液合并,既得分离提取液;

步骤五:将经过步骤四处理所得的分离提取液,先用1mg:1~10mL的乙醇溶解后,采用硅胶拌样后挥干,称取20倍于样品量的硅胶,使用湿法进行填柱和上样;首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净,再依次用以下6种洗脱液进行洗脱:体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、

5:2、1:1、1:3、1:5的二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、

1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,以及甲醇洗脱液;然后TLC控制收集主馏分,使用旋转蒸发仪将各个馏分溶液蒸干后,用适量甲醇溶解,再用0.22μm的滤膜过滤后,即得各种靛玉红衍生物分离液;

步骤六:将经过步骤五处理所得的各种靛玉红衍生物分离液,采用高效液相半制备法分离纯化,HPLC梯度洗脱法控制收集不同的靛玉红衍生物洗脱液,减压蒸去溶剂后,用甲醇结晶,即得靛玉红衍生物。

2.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:所述土豆培养基为:土豆200g/L,葡萄糖20g/L;配置时将土豆去皮后将其切成小块,加水加热煮沸30min,过滤。取滤液定容至1L,加入葡萄糖20g,搅拌溶解后,121℃灭菌30min,即得;

所述斜面培养基为:取上述土豆培养基1L,加入琼脂粉各20g,加热溶解后分装于玻璃试管中,于121℃下灭菌30min后取出,倾斜45度,静置、冷却既得。

3.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:所述转化菌种为下述微生物中任意一种:

短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana)包括:AS3.970;AS3.153;AS3.910;AS3.954,AS3.2016;AS3.2017;AS3.2018;AS3.3401;或者刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)包括:AS3.154;AS3.952;AS3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2

000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans.)包括:AS3.156;AS3.

1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克银汉霉CFCC5029;或者Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton,teleomorph ATCC9245;ATCC8688a;ATCC8983;

或 者 Cunninghamella echinulata(Thaxter)Thaxter var.echinulata,teleomorph ATCC11585a;ATCC36190;ATCC11585b;ATCC9244;或 者 Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton,teleomorph ATCC11064;ATCC10028a;或 者Cunninghamella elegans ATCC36112;ATCC26269;ATCC10028b;黑曲霉Aspergillus niger包括:AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;、AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858;AS3.2931;AS3.3882;AS3.3883;AS3.4303;AS3928;AS3.4304;AS3.4309;AS3.446

3;AS3.4304;AS3.4523;黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。

4.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成:A组:A1为水杨酸,A2为乙酰水杨酸,A3为磺基水杨酸,A4为苯甲酸,A5为水杨酸甲酯、A6为对氨基水杨酸、A7为3,5-二硝基水杨酸酯、A8为3,5-二硝基水杨酸、A9为硫代水杨酸、A10为5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸醇/异莰醇酯、A11为5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸、A12为水杨酸4-庚烯-2-基酯、A13为水杨酸辛酯、A14为水杨酸锌、A15为水杨酰胺、A16为水杨酸钠、A17为乙酰水杨酸钠、A18为5-磺基水杨酸、A19为5-磺基水杨酸钠、A20为苯甲酸钠、A21为水杨酸乙酯、A21为对氨基水杨酸钠、A22为水杨酸镁;B组:B1为茉莉酸甲酯,B2为β-环糊精,B3为壳聚糖,B4为茉莉酸,B5为为羧甲基-β-环糊精,B6为2,6-二甲基-β-环糊精,B7为谷胱甘肽,B8为2-羟乙基茉莉,B9为磺丁基-β-环糊精,B10为羟乙基-β-环糊精,B11为甲壳素;B12为小克银汉霉属AL4粗诱导子,B13为α-环糊精,B14为2-羟丙基-β-环糊精,B15为甲基化-β-环糊精;

C组:C1为卡马西平,C2为莫达非尼,C3为奈韦拉平,C4为利福平,C5为贯叶连翘,C6为异烟肼,C7为胰岛素,C8为奥美拉唑,C9为苯巴比妥,C10为泼尼松,C11为泼尼松龙,C12为地塞米松,C13为倍他米松,C14为倍氯米松,C15为戊酸倍他米松,C16为醋酸地塞米松,C17为9-氟-16α-甲基11β,17-二羟基-3-氧-1,4-雄二烯-17β-羧酸。

5.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:

TLC控制收集主馏分,用体积比为5:4:4的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯为展开剂;

所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为:色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm,粒径为5μm;吸收波长:292nm,流动相体积比:甲醇:水=75:25,流速:0.5ml/min、柱温:25℃、进样量100μl。

6.如权利要求1~5所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:所述方法可用于制备以下靛玉红衍生物:A类:1`-(2-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;

1`-(3-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;1`-(4-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;1`-(5-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;或者1`-(2-磺酸-4-甲基酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(2-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;

1`-(3-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(4-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(5-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(5-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(5-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、

1`-(5-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;

B类:与A类化合物取代基相同的1位的取代的靛玉红衍生物;

C类:在A类或者B类化合物各种取代位置上增加5或者5’羟基取代的靛玉红衍生物;

D类:1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、

1,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,6-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红,1,6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,7-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、

6,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红,4,4′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6,6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红和7,7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红。

7.一种靛玉红衍生物,其由如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法制得,其特征在于:所述靛玉红衍生物的结构式Ⅰ如下:其中R1和R2独立地是氢、烷基,其中的任何一个,可以由烷基、磺基或者烷磺基取代,其中所述烷基、或者烷磺基包括至多六个碳原子;基团X中,即X1,X2,X3,X4,X5,X6中至多有两个烷基、羟基、磺基或者烷磺基,其余为氢,结构式Ⅰ中连接R1、R2及基团X的“—”键可代表或

8.如权利7所述一种靛玉红衍生物,其特征在于:

当R1为SO3H时,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6,中有一个为(CH2)nCH3,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nCH3,一个为CH3,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nCH3,一个为OH,其余为氢;或者其中一个为(CH2)n,一个为OH和一个为CH3,其余为氢;

当R1为(CH2)nCH3,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中其中有一个为SO3H,其余为氢;或者其中有一个为SO3H,一个为OH,其余为氢;

当R1为CH3时R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6中有一个为(CH2)nSO3H,其余为氢;或者其中一个为SO3H,一个为(CH2)n,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nSO3H,一个为OH,其余为氢;或者其中一个为SO3H,一个为(CH2)n,一个为OH,其余为氢;

当R1为(CH2)n,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中一个为SO3H,一个为CH3,其余为氢;或者其中一个为SO3H、一个为CH3、一个为OH,其余为氢;

当R1为(CH2)nSO3H,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中一个为CH3,其余为氢;或者其中一个为CH3,一个为OH,其余为氢;或者R1和R2均为H时,X1,X2,X3,X4,X5,X6中至多两个为羟基,其余为氢;其中,所述n=1~6。

9.如权利7所述一种靛玉红衍生物,其特征在于:所述靛玉红衍生物具体为:

1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红、

1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红、1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红、5-羟基-靛玉红、5`-羟基-靛玉红。

10.如权利7~9任一项所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与肿瘤相关的疾病,包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌。

11.如权利7~9任一项所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与病毒相关疾病,包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。

12.如权利7~9任一项所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与心肌缺血再灌注损伤相关的疾病,包括冠心病、心肌病、心衰和心肌梗塞。

13.一种靛玉红衍生物,其由如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法制得,其特征在于:所述靛玉红衍生物的结构式II如下:其中R1′和R2′独立地是氢或者磺基或者双磺基取代,基团X′中,即X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′中至多有两个磺基或者羟基,其余为氢;结构式II中连接R1′、R2′及基团X′的“—”键可代表 或

14.如权利要求13所述的一种靛玉红衍生物,其特征在于:

当R1′为SO3H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有一个为SO3H,其余为氢;或者R1′为SO3SO3H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′均为氢;

或者R1′为H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有两个为SO3H,其余为氢;或者R1′为H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有一个为SO3SO3H,其余为氢。

15.如权利要求13所述的一种靛玉红衍生物,其特征在于:所述靛玉红衍生物具体为:1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1′,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红和5′,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红。

16.如权利13-15任一项所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与肿瘤相关的疾病,包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌。

17.如权利13-15任一项所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与病毒相关疾病,包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。

18.如权利13-15任一项所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与心肌缺血再灌注损伤相关的疾病,包括冠心病、心肌病、心衰和心肌梗塞。