1.一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：活性成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WN5和干酪乳杆菌SN3(Lactobacillus casei)。

2.根据权利要求1所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：所述活性成分的制备方法是：

一、菌株的分离和纯化：收集淤泥的浸出液，按体积比1:10的比例加入到无菌水中混匀，连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37℃厌氧培养

48h；挑取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线3次得到纯的单菌落；挑取单菌落于没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中,观察是否产气,产气菌株为异型发酵乳酸菌,不产气菌株为同型发酵乳酸菌；共分离出175个纯化的同型和异型发酵乳酸菌株；这些菌株接入MRS液体培养基中, 37℃厌氧培养20h,取其中的700微升菌液并加入300微升灭菌甘油,然后混匀,-20℃冻存；

二、抑酵母试验：取出-20℃条件下保存的乳酸菌,取5微升注入MRS固体培养基上涂布, 在温度37℃的条件下培养12～14h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种于装有5mlMRS培养基的10ml试管中,在温度37℃的条件下培养16～18h，得到活化的乳酸菌；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中,装液量为100ml，37℃培养16～18h,此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993

10

× 10 cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物一；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入装有MRS液体培养基的250 ml三角瓶中,装液量为100 ml；37℃培养

10

16～18h, 此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有1.0×10 cfu乳酸菌；5000转离心

5min,收集上清液,获得抑菌物二；将酵母菌Saccharomyces cerevisiae于YPD液体培养基中28℃静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力，双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物二的抑菌能力； 三、菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法测定乳酸菌的药敏性，得到16株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株；

四、菌株的共同培养试验：取出-20℃条件下保存的6株乳酸菌进行活化，将活化的6株乳菌液按cfu比1:1的比例混合，得到进行菌株共同培养的种子液,按1%的接种量,将混合后的上述种子液接种于不含碳酸钙的MRS液体培养基，37℃静止培养,间隔1天测菌液浓度和培养基pH值,连续测定7天，菌株WN5和SN3的组合表现出最好的增殖优势和存活优势；

五、菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株WN5和SN3分别进行生物学特性和

16S-23S rDNA间隔区序列鉴定。

3.根据权利要求2所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：步骤二中双层琼脂平板打孔法测定是指，将20ml的MRS固体培养基注入直径25cm的培养皿中,冷却1h；取6mL酵母菌培养液加到100ml冷却至45℃的YPD半固体培养基中，摇匀，并迅速倒在底层MRS培养基上；在底层MRS培养基的上面、间隔相等距离处放置3个被剪短的lml移液器Tip头；该被剪短Tip头的高为1cm,直径为0.9cm；冷却注入的YPD半固体培养基,时间为1h,此时, 制成双层培养基；取出Tip头,制成用于放置抑菌物的洞口；取相同浓度的上述乳酸菌抑菌物一,体积数为150微升, 加入其中两孔中；剩余一个作为对照,加入150微升的灭菌俄水；37℃培养48h,测定和记录乳酸菌对酵母菌的抑菌圈直径；所述YPD液体培养基每升的组分及含量为: 酵母粉10 克，蛋白胨20克，葡萄糖20克；所述YPD半固体培养基每升的组分及含量为: 酵母粉10 克，蛋白胨20克，葡萄糖20克,0.7%的琼脂粉。

4.根据权利要求2所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：步骤三中制备不同浓度的抗生素滤纸片是指，将链霉素、环丙沙星和庆大霉素均配置成80 µg/ml、320µg/ml和1280µg/ml的三个浓度梯度，阿莫西林、红霉素和头孢拉定均配置成

0.625 µg/ml、20µg/ml和80µg/ml的三个浓度梯度， 以滤纸制备直径为0.6cm的圆形滤纸片,将它们放入上述抗生素溶液中,得到不同浓度的抗生素滤纸片。

5.根据权利要求2所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：所述步骤三中培养乳酸菌是指，取出-20℃条件下保存的乳酸菌,取 5微升注入MRS固体培养基上,涂布, 在温度37℃的条件下培养12～14h，用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种于装有5mlMRS培养基的10ml试管中,在温度37℃的条件下培养16～18h得到活化的乳酸菌，将活化的乳酸菌按1%的接种量接入装有MRS液体培养基的250ml三角瓶中,装液量为100ml, 37℃培养16～18h,得到乳酸菌液,此时,每毫升MRS液体培养基

10

中至少含有0.993 × 10 cfu乳酸菌，用无菌水稀释每毫升乳酸菌的菌液浓度为1.5 ×

8

10 cfu。

6.根据权利要求2所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：步骤四中乳酸菌的活化是指，将20ml的不添加碳酸钙的MRS固体培养基注入直径25cm的培

8

养皿中,冷却1h，吸取100微升的每毫升浓度为1.5 × 10 cfu的乳酸菌液于培养基中央涂板，取4张滤纸片, 这4张滤纸片分别为3张同种抗生素但浓度不同的抗生素滤纸片,第4张滤纸片为不含抗生素的对照，待琼脂表面吸收乳酸菌后, 贴间隔均匀适中的上述4张滤纸片于每个培养皿的琼脂表面，静置 5分钟后,翻转平皿，37℃静止培养24h,测定和记录抗生素对乳酸菌的抑菌圈直径。

7.根据权利要求2或3或4或5或6所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：MRS液体培养基每升的组分及含量为: 蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、 葡萄糖 10 g/L、 蔗糖 15 g/L、牛肉膏 10 g/L、柠檬酸氢二铵 2 g/L、乙酸钠 5 g/L、丙酮酸钠0.18 g/L、L-光胱胺酸盐酸盐 0.05 g/L、血红素0.5 g/L、维生素K2 2 g/L、碳酸钙 10 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO4·H2O 0.25 g/L、Tween-80 1ml/L, pH值为6.4, 121℃灭菌15分钟；MRS固体培养基每升的组分及含量为: MRS液体培养基中加入质量百分比1.5%琼脂粉, pH值为6.4, 121℃灭菌15分钟。

8.根据权利要求2所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：步骤五中16S-23S rDNA间隔区的序列鉴定是指，菌株WN5的16S-23S rDNA间隔区的核苷酸序列与植物乳杆菌WCFS1（AL935263）的同源性最高，其同源性为98%；菌株SN3的16S-23S rDNA间隔区的核苷酸序列与干酪乳杆菌W56（HE970764）的同源性最高，其同源性为97%。

9.根据权利要求2所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：步骤五中菌株的生物学特性鉴定是指，菌株WN5为革兰氏阳性菌，菌落乳白色、菌落表面光滑、细胞呈杆状、生长温度10～45℃、最适温度32～38℃、接触酶阴性、过氧化氢酶阴性、最适碳源葡萄糖、最适无机磷盐K2HPO4；菌株 SN3为革兰氏阳性菌，菌落乳白色、菌落表面光滑、细胞呈短杆状、生长温度10～45℃、最适温度32～38℃、接触酶阴性、过氧化氢酶阴性、最适碳源葡萄糖、最适无机磷盐Na2HPO4。