1.一种利用2-DE技术筛选钝齿棒杆菌内源高活性启动子的方法,其特征是:
通过2-DE技术筛选钝齿棒杆菌内高表达蛋白质,通过MALDI-TOF-MS及MS/MS分析鉴定和数据库检索,鉴定出这些蛋白的种类,在GENBANK网站上检索出这些蛋白的编码基因序列,克隆其上游的启动子序列。
2.一种携带权利要求1中启动子片段的探测载体,其特征是:
将权利要求1中的启动子基因片段替换穿梭质粒pDXW-8上的tac-M启动子,并在其下游插入氯霉素乙酰转移酶的基因cat,获得几种启动子片段的探测载体,分别命名为pDXW-PargC-cat、pDXW-PargG-cat、pDXW-PargF-cat、pDXW-PilvC-cat和pDXW-PserA-cat。
3.一种携带权利要求2中探测载体的重组菌株,其特征是:
将权利要求2中的探测载体用热击转化法转化到宿主菌大肠杆菌JM109中,获得重组大肠杆菌:E.coli JM109/pDXW-PargC-cat、E.coli JM109/pDXW-PargG-cat、E.coli JM109/pDXW-PargF-cat、E.coli JM109/pDXW-PilvC-cat、E.coli JM109/pDXW-PserA-cat;将权利要求
2中的探测载体用电击转化法转化到宿主菌钝齿棒杆菌SYPA5-5中,获得重组钝齿棒杆菌:
C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PargC-cat、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PargG-cat、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PargF-cat、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PilvC-cat、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PserA-cat。
4.权利要求3中重组菌的CAT酶活测定,其特征是:
将权利要求3中的重组菌株发酵测定CAT的酶活力,测得重组大肠杆菌的酶活力分别为:E.coli JM109/pDXW-PargC-cat 为 0.36U/mg、E.coli JM109/pDXW-PargG-cat 为 5.58U/mg、E.coli JM109/pDXW-PargF-cat为 3.81U/mg、E.coli JM109/pDXW-PilvC-cat 为 3.73U/mg、E.coli JM109/pDXW-PserA-cat为1.26U/mg;测得重组钝齿棒杆菌的酶活力分别为:C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PargC-cat 为 0.09U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PargG-cat为 1.86U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PargF-cat 为 1.19U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PilvC-cat为1.12U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-PserA-cat为0.089U/mg,以上结果可以看出在重组菌中各启动子的活性:P-argG>P-argF>P-ilvC>P-serA>P-argC。这是首次获得了来自于钝齿棒杆菌内组成型高表达启动子,为钝齿棒杆菌高表达外源基因提供了有效的工具。