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专利号: 2012104000317
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1. 一种测定赭曲霉毒素A的适配体传感器的构建方法,其特征在于包括:链霉亲和素包被PCR管,适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面,适配体传感器的构建;具体步骤为: (1)链霉亲和素包被PCR管 首先将PCR管用50 μ L质量浓度O. 8%的戊二醛溶液在37°C包被5h,然后用超纯水将PCR管洗涤三次,每次3min ;再用pH7. 2,0. OlM的碳酸盐缓冲液稀释的12. 5ng/mL的链霉亲和素包被PCR管,每管30 μ L在37°C孵育2h,孵育结束后再用上述碳酸盐缓冲液洗涤三次,每次3min,以去除未结合的链霉亲和素; (2)适配体与其部分互补的DNA片段杂交并固定在PCR管表面 用含750mM NaCl,75 mM C6H5Na3O7、pH 8. O杂交缓冲液将适配体和部分互补于适配体的DNA片段分别稀释到50nM和ΙΟΟηΜ,并将两者以I: I的体积比充分混合,将混合液于每个PCR管加入30 μ L,并在37°C条件下孵育40min,以使互补双链充分杂交并结合到PCR管表面; 所述单链DNA适配体片段和部分互补于适配体的DNA片段序列分别为: 适配体:5’ -GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGG-biotin-3’, 与适配体部分互补的DNA片段:5’ -CCCACACCCG ATCGGGAAAA TGCAAGAAGA AGTCATTAGT CCTAGACAAC GTTACTATAA CGTGAATGTA ATGAACCTACAAGACCTTCC AGATTTTTCG GC-3’ ; (3)适配体传感器的构建 在步骤(2)包被好的每个PCR管中,分别加入30 μ L 5Xl(T6ng/g〜5 ng/g的十倍梯度稀释的赭曲霉毒素A标准品,在45°C孵育40min,使赭曲霉毒素A和适配体充分结合,结合缓冲液为含 10 mM Tris、120 mM NaCl,5 mM KCl,20 mM CaCl2、pH 7.0 的缓冲液,反应结束后,再用结合缓冲液洗涤三次,每次3min,最后将PCR管拍打干净,以去除未结合的赭曲霉毒素A和双链变性释放出的部分互补于适配体的DNA片段; 每个PCR管在30 μ L的体系中进行反应,此体系由以下反应物质组成:各O. 6 μ L终浓度均为2μ M的上游引物和下游引物,I. 8μ L 20 X EvaGreen染料,3 μ L终浓度为ImM的dNTP混合液,3yL 10XPCR缓冲液,O. 3μ L浓度为5U的Taq DNA聚合酶和超纯水补足30 μ L ;将反应物充分混匀,最后用荧光定量PCR仪CFX-96进行测定,扩增条件为:首先95°C预变性30s ;然后95°C变性5s、57°C退火和延伸30s,总共为39个循环;得到互补于适配体的DNA片段的扩增曲线;再从65°C升温至95°C,每O. 5°C读取一次荧光值,使得扩增后的双链DNA变性,得到DNA熔解曲线; 上游引物:5’ -GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CAT-3’, 下游引物:5’ -GCCGAAAAAT CTGGAAGGTC-3’。