1.一种功能化磁性微球的制备方法,其特征在于,以多孔有机物为基体,通过共沉淀法、水热法或高温分解法使磁性微球分布在多孔有机物的孔结构中,制成的负载磁性微球的多孔有机物,磁性微球的粒径大小为50nm-2μm;
所述共沉淀法的制备方法如下:
将1-3g多孔有机物基体、3-8g金属无机盐、1-3g晶体修饰剂与30-100mL反应溶剂1混合,将混合溶液以30-50滴/min的速度滴加至30-50mL、浓度为0.1-1mol/L的碱溶液中,持续搅拌1-3h,用去离子水洗涤至洗涤液pH为中性,烘干,即得;
所述水热法的制备方法如下:
将1-3g多孔有机物基体、3-8g金属无机盐、2-5g表面修饰剂与50-100mL反应溶剂2混合后,剧烈搅拌30-50min,然后密封在聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中,150-200℃加热并保持12-24h后,冷却到室温,将产物用超纯水和无水乙醇反复冲洗后,真空干燥,即得;
所述高温分解法的制备方法如下:
将1-3g多孔有机物基体、2-6g金属有机盐、1-4g表面活性剂与30-80mL反应溶剂3混合,在50-80℃加热并保持3-6h,冷却至30-40℃,采用蒸馏水与无水乙醇反复清洗后,3000-6000r/min离心,得到蜡状固体形态的金属复合物;将金属复合物加入50-80mL反应溶剂4,搅拌下加热升温至200-250℃保温0.5-2h,通氮气或氩气作为保护气体,其流量为150-250mL/min,反应完成以后停止加热,用丙酮或无水乙醇反复清洗,即得。
2.根据权利要求1所述功能化磁性微球的制备方法,其特征在于,所述多孔有机物基体的制备方法如下:S1.将0.1-5g有机物粉末溶解在10-50mL、0.05-1mol/L弱酸的水溶液中,40-60℃水浴加热,持续搅拌6-8h,得到有机物的弱酸溶液;
S2.将0.5-2g孔结构修饰剂溶于10mL水中,80-90℃水浴加热并持续搅拌10-16h,得到孔结构修饰剂水溶液;
S3.将S1的有机物的弱酸溶液和S2的孔结构修饰剂水溶液进行混合,超声去气泡后,滴入0.1-2mol/L的碱溶液中固化形成有机物凝胶球,持续搅拌0.5-1h后,用去离子水洗涤至洗涤液pH为中性,烘干,即得多孔有机物基体。
3.根据权利要求2所述功能化磁性微球的制备方法,其特征在于,
所述有机物为阿拉伯胶、乙基纤维素、羧甲基纤维素钙、海藻酸钠、乙二醇壳聚糖、透明质酸壳聚糖、羟丙基壳聚糖、甲基丙烯酸酯化明胶、壳寡糖、羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维素钠、葡聚糖、羧甲基纤维素、海藻酸钙、玉米淀粉、羧甲基淀粉钠、海藻酸胺、海藻酸钾、羟丙基淀粉醚中的至少一种;
所述弱酸为蚁酸、冰醋酸、酒石酸、柠檬酸中的至少一种;
所述孔结构修饰剂为甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、分子量为200-10000的聚乙二醇、聚合度200-3000的聚乙烯醇、丙氨酸、葡萄糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯醇缩丁醛、羧甲基纤维素、聚丙二醇中的至少一种;
所述碱溶液为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化钠、三乙胺、异丙胺、氢氧化钾、乙二胺溶液中的至少一种。
4.根据权利要求1所述功能化磁性微球的制备方法,其特征在于,
所述金属无机盐为金属的盐酸盐、碳酸盐、硝酸盐、碱式碳酸盐、硫酸盐中的至少一种;
所述金属有机盐为金属的棕榈酸盐、油酸盐、亚油酸盐、硬脂酸盐、软脂酸盐、乙酰丙酮盐中的至少一种;
所述金属为钴、镍、铁、锰中的至少一种;
所述晶体修饰剂为聚氧乙烯醚、聚乙烯醇、三乙胺、三乙基二胺、聚乙烯比咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚丙烯亚胺、烷基磺酸钠、脂肪酸钠、十二烷基硫酸钠、羧酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙二醇、聚氧化乙烯、十二烷基苯磺酸钠、P123、F127中的至少一种;
所述表面修饰剂为三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、碳酸钠、植酸钠、碳酸氢钠、水杨酸钠、硼酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、海藻酸钠、碳酸钾、焦硫酸钠、碳酸氢钾、磷酸氢钾、乳酸钠、丙烯酸钠、磷酸二氢钾中的至少一种;
所述表面活性剂为三丙胺、三正丙胺、二异丙胺、二异丙醇胺、二异丁胺、二异戊胺、二异辛胺、二辛基甲胺、三正戊胺、三正己胺、三正庚胺、三正辛胺、三正壬胺、三月桂胺、三乙醇胺、三异丙醇胺、苯胺、二苯胺、十二烷基硫酸钠、油胺、聚乙烯醇、帕洛沙姆、聚山梨醇酯和烷基二苯醚二磺酸盐中的至少一种;
所述反应溶剂1为水和一元醇或多元醇的混合溶液,其中水:醇的体积比为1:1,一元醇为甲醇、乙醇中的至少一种;所述多元醇为乙二醇、丙三醇、异丙醇、戊二醇、生物质多元醇中的至少一种;
所述反应溶剂2为丙二醇、丁二醇、十二醇、酚二醇、雌二醇、新戊二醇、二甘醇、辛二醇、癸二醇、聚乙二醇、己二醇、丁烯二醇、三乙二醇、1,4-丁二醇、甘油、1,2,3-丙三醇、十六烷二醇、1,5-戊二醇中的至少一种;
反应溶剂3为乙醇、水、烷烃按1:1:2的体积比制成的混合溶剂,其中,烷烃为正癸烷、正辛烷、正戊烷中的至少一种;
反应溶剂4为二苄醚、辛醚、1-十八烯、3-溴二苯醚、月桂酸、二苯醚、油酸、4-氯二苯醚、辛酸、癸酸、亚油酸、2-羟基二苯醚、棕榈酸、4-氨基二苯醚、硬脂酸、软脂酸、乙酰丙酮、油醇、松油醇中的至少一种。
5.权利要求1-4任一项所述方法制备的功能化磁性微球。
6.权利要求5所述功能化磁性微球在制备肌钙蛋白检测试剂中的应用。
7.一种肌钙蛋白抗体修饰的功能化磁性微球,其特征在于,由以下方法制备而成:
取权利要求5所述功能化磁性微球加分散溶剂,之后加入偶联剂,37℃孵育30-50min,孵育结束后磁分离弃上清,分散溶剂清洗两次并重悬,加入第一抗人肌钙蛋白单克隆抗体I和第二抗人肌钙蛋白单克隆抗体Ⅱ,37℃摇床孵育2-4h;孵育结束后,对溶液磁分离,后用分散溶剂定容至所需浓度,4℃保存。
8.根据权利要求7所述肌钙蛋白抗体修饰的功能化磁性微球,其特征在于,
所述分散溶剂为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液,浓度为0.01-0.05mol/L,pH值为5.5-7.4,其中含有体积分数为5%-15%的马血清;
所述偶联剂为酒石酸二琥铂酰亚胺酯、辛二酸二琥珀酰亚胺、二(N-琥珀酰亚胺)乙二醇二琥珀酸酯、3,3'-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)、溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、双琥珀酰亚胺辛二酸酯磺酸钠盐、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯中的至少一种;
所述第一抗人肌钙蛋白单克隆抗体为Troponin I-Cardiac(41-49)Mab,所述第二抗人肌钙蛋白单克隆抗体为Troponin I-Cardiac(87-91)Mab。
9.一种肌钙蛋白检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求7或8所述肌钙蛋白抗体修饰的功能化磁性微球、信号标记物标记抗体、缓冲液、清洗液、增强剂、氧化剂;
其中,所述信号标记物标记抗体为信号标记物标记的第三抗人肌钙蛋白单克隆抗体ⅡI;
所述信号标记物为4-氨基邻苯二甲酰肼、N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺、异鲁米诺、鲁米诺单钠盐中的一种;
所述缓冲液为MES缓冲液、Tris缓冲液、PBS缓冲液中的一种,pH为6.5-8,浓度为0.01-0.05mol/L;
所述清洗液为含体积浓度0.01%-0.1%的Proclin300和0.05-0.2M的2-(N-吗啉代)乙磺酸的水溶液;
所述增强剂为5(6)-羧基荧光素、荧光素二钾、6-氨基荧光素、荧光素钠、D-荧光素钾盐、5-氨基荧光素、6-硝基荧光素、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、二乙酸荧光素、5(6)-氨基荧光素、氯化血红素中的至少一种;
所述氧化剂为四对氯苯基卟啉铁、四对氯苯基卟啉铜、四对甲苯基卟啉铁、四对甲苯基卟啉铜、四对甲苯基卟啉镍、四对氯代苯基卟啉锰、四对氯代苯基卟啉镍、四对甲氧苯基卟啉钴、四对甲氧苯基卟啉铜、四对甲氧苯基卟啉镍、四对氯代苯基卟啉钴、四对苯甲酸卟啉锰、四(对氨基苯基)卟啉镍、四对苯甲酸卟啉铁、四对苯甲酸卟啉铜、四(对溴苯基)卟啉锌、铂(II)meso-四(4-羧基苯基)卟啉、氨基卟啉锌、四苯基卟啉铜中的至少一种。
10.根据权利要求9所述肌钙蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述信号标记物标记抗体的制备方法如下:将信号标记物加入到酸溶液中,搅拌溶解后,加入亚硝酸盐,避光反应10-30min;然后用0.1-0.5M、pH10的缓冲溶液调节pH为8.5,加入第三抗人肌钙蛋白单克隆抗体ⅡI,在0~4℃条件下避光反应24h,即得;
所述酸溶液为盐酸、硝酸或硫酸,浓度为0.5-2mol/L;
所述亚硝酸盐为亚硝酸钴钠、亚硝酸钴钾、亚硝酸钾、亚硝酸钠、亚硝酸钙中的至少一种;
所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、苹果酸缓冲溶液、橼酸缓冲溶液、琥珀酸缓冲溶液、酒石酸缓冲溶液、硼酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、乳酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液的任一种。