1.一种基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:步骤1、电极预处理:
在含有H2SO4和KCl的溶液中对丝网印刷碳电极SPCE进行清洗,进行循环伏安扫描,得到稳定的循环伏安曲线后,用二次水淋洗,氮气吹干,备用;
丝网印刷碳电极SPCE表面设有中心电极区域和外围非电极区域;电极区域包含一个碳工作电极、一个碳辅助电极和一个Ag/AgCl参比电极;
步骤2、构建微型池:
在步骤1预处理过的SPCE的非电极区域覆盖一层聚二甲基硅氧烷PDMS膜,形成微型池;
步骤3、制备修饰电极:
在步骤2中SPCE的电极区域中碳工作电极上电沉积金纳米颗粒Au NPs,制得Au NPs修饰的SPCE工作电极,记为Au NPs/SPCE;
步骤4、电化学生物传感的构建:
将引物混合溶液滴在Au NPs/SPCE电极表面,反应一段时间后,用PBS淋洗以除去过量的未结合的引物,最终得到带有引物的电极,记为Primer/Au NPs/SPCE;
步骤5、ASFV的原位LAMP:
将核酸扩增反应液和ASFV标准样品混合均匀后滴于步骤4中制备好的Primer/Au NPs/SPCE电极表面,然后将电极置于加热器孵育一段时间后,得到用巯基连接的扩增产物dsDNA/Au NPs/SPCE,构成基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
步骤1中,含有H2SO4和KCl的溶液中,H2SO4的浓度为0.5M,KCl的浓度为0.1M;含有H2SO4和KCl的溶液用量为5mL;循环伏安扫描的范围设定为‑0.2~1.5V,扫描速率为100mV/s;碳工作电极的直径为3mm;
步骤2中,聚二甲基硅氧烷PDMS膜的厚度为3‑5mm。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
步骤3中,电沉积Au NPs的具体操作为:在新配制的2mM HAuCl4溶液中,采用低电位和高电位分别为‑0.2V和1.2V,扫描速率为100mV/s,‑0.2V为起始电位和终止电位,电沉积40圈得Au NPs/SPCE,超纯水淋洗,氮气吹干备用。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
步骤4中,采用引物V5在线软件设计ASFV p54基因的4个引物:巯基修饰的正向内引物SH‑FIP,反向内引物BIP,正向外引物F3和反向外引物B3;4条引物的序列分别为:SH‑FIP:SH‑TGCTGGTCTGTTTGTTGCCGGGGAGCGACTACAGCAAGTG;
BIP:AGACTAGTCATGGCAACTGGCGCGGATGAGCAGGAGCACT;
F3:TCCACAACCAGGTACCTCTA;
B3:AGTGACTGTCGTGTAAGGCT。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤4中,所述引物混合溶液的制备步骤如下:将浓度均为100μM的SH‑FIP、BIP、F3、B3溶液按体积比8:8:1:1混合成引物溶液,然后将引物溶液与海藻糖溶液、双蒸汽水按体积比1:1:4的比例混合,形成引物混合溶液;
引物混合溶液的滴加量为6μL,反应时间2h,反应温度为37℃。
6.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
步骤5中,ASFV标准样品与核酸扩增反应液的体积比为1:4,其中,ASFV标准样品浓度为‑12 ‑6
10 ‑10 g/L。
7.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,
步骤5中,核酸扩增反应液和ASFV的混合液滴加量为5μL;加热孵育的温度为63℃,时间为45min。
8.将权利要求1~7任一项所述制备方法制得的基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器用于检测ASFV的用途。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,具体步骤为:(S1)在权利要求1所得传感器的非电极区域构建的微型池中,加入含5.0mM[Fe(CN)6
3‑/4‑
] 和0.1M KCl的PBS缓冲溶液,用电化学工作站收集CV信号;将电流值与ASFV标准样品浓度的对数值做标准曲线;
(S2)将未知浓度的ASFV阳性样品溶液和核酸扩增反应液混合均匀后滴于Primer/Au NPs/SPCE电极表面,然后将电极置于加热器孵育一段时间后,得到用巯基连接的扩增产物dsDNA/Au NPs/SPCE,采用步骤S1方法收集电流信号,并代入标准曲线中,得出ASFV阳性样品的浓度。
10.如权利要求9所述的用途,其特征在于,步骤(S1)中,CV测量时,测试范围在‑0.2~
0.6V,扫描速率为100mV/s;所使用的PBS缓冲溶液浓度为100mM,pH=7.4;
步骤(S2)中,ASFV阳性样品溶液与核酸扩增反应液的体积比为1:4,核酸扩增反应液和ASFV的混合液滴加量为5μL;加热孵育温度为63℃,时间为45min。