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专利号: 2022101504221
申请人: 大连工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-03-12
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.基于辅因子代谢工程策略提高蛹虫草菌虫草素产量的基因改造,其特征在于,过表达葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶编码基因gsdA或6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gndA,强化NADPH的供应以提高虫草素产量,基因gsdA及gndA来源于蛹虫草菌,基因gsdA具有如SEQ ID NO.3所示序列,基因gndA具有如SEQ IDNO.4所示序列。

2.一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法,其特征在于:

通过基因工程的手段将目的基因gsdA或gndA导入蛹虫草菌中构建基因过表达的蛹虫草重组菌株。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,运用根癌农杆菌介导转化技术将过表达葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶编码基因gsdA或6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gndA的重组质粒导入蛹虫草中,构建蛹虫草重组菌株。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,蛹虫草重组菌株构建方法如下:

S1.提取蛹虫草Cordyceps militaris的mRNA,逆转录制备cDNA,以cDNA为模板克隆gsdA或gndA基因;

S2.将目的基因gsdA或gndA与线性化载体pDHt‑SK‑BenA连接后,转入大肠杆菌感受态细胞中,经PCR扩增、酶切、基因测序等验证筛选转化子,获得含重组载体pDHt‑SK‑BenA‑gsdA/gndA的大肠杆菌;

S3.液体培养S2得到的含重组载体的大肠杆菌,提取质粒,将所述重组载体转入根癌农杆菌AGL‑1感受态细胞中,利用含50‑100μg/mL羧苄青霉素及50‑100μg/mL卡那霉素的YEB固体培养基进行培养并筛选转化子,经PCR扩增、酶切等验证后,获得含重组载体pDHt‑SK‑BenA‑gsdA/gndA的根癌农杆菌;

S4.将步骤S3得到的含重组载体pDHt‑SK‑BenA‑gsdA/gndA的根癌农杆菌在IM液体培养基中诱导培养后,与蛹虫草菌孢子悬液在IM固体培养基上共培养,同时覆盖含头孢噻肟和苯菌灵的M‑100固体培养基,筛选蛹虫草转化子并进一步在含头孢噻肟和苯菌灵的M‑100固体培养基上进行二次筛选,经PCR扩增、基因测序等验证,得到过表达葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶编码基因gsdA或6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gndA的蛹虫草重组菌株。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,目的基因gsdA/gndA为通过PCR技术以蛹虫草cDNA为模板扩增得到,PCR扩增所用引物对为gsdA‑F:5’‑ATGATGCACAAGACCATTAAGAACA‑

3’;gsdA‑R:5’‑TTACAGCTTGTTGCTAGAGTTGTTGT‑3’;gndA‑F:5’‑ATGTCTGGTCCTGTTGCTCGA‑

3’;gndA‑R:5’‑TTAAGCCTGGTAGGTAGAGGCAG‑3’。

6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,线性化载体为含有苯菌灵抗性基因BenA的表达载体pDHt‑SK‑BenA,BenA基因序列如SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求2所述方法构建的蛹虫草重组菌株在液体深层发酵体系积累虫草素的应用。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,蛹虫草重组菌株是在合成培养基中开展液体深层发酵积累虫草素,所述合成培养基包括葡萄糖、无机盐、氨基酸和维生素B1。

9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,合成培养基具体包括:20‑50g/L葡萄糖、5‑

10g/L硫酸铵、0.5‑1g/L磷酸氢二钾、0.5‑1g/L磷酸二氢钾、0.5‑10g/L硫酸镁、0.5‑15g/L硫酸锌、5‑10g/L甘氨酸、0.5‑1g/L天门冬氨酸、0.5‑2g/L谷氨酰胺、0.1‑0.5g/L酪氨酸、0.05‑

0.2g/L半胱氨酸、0.5‑1g/L亮氨酸、0.5‑2g/L赖氨酸、0.05‑0.5g/L苯丙氨酸、0.1‑1g/L维生素B1。