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专利号: 2021112227478
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的引物组合物,其特征在于,包括:正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和环引物LB;碱基序列如下:FIP:5’‑AGCTGGCTTTGAGAGGAAAGCTAATGGTTTCTTGATCAAGAAGGC‑3’;

BIP:5’‑TAGTAGGGTCTACTTTGCTGATCCTATAGGTTTGCAAAAGCCCAAG‑3’;

F3:5’‑TGTCGTGATATCTTCAACCTT‑3’;

B3:5’‑AGTCTCTGACGAGACAGTT‑3’;

LB:5’‑AGCAAAAGCCTCCAAATTCCAA‑3’。

2.一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的试剂盒,其特征在于,包含如权利要求1所述的引物组合物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,包含:10mM正向内引物FIP、10μM反向内引物BIP、10μM正向外引物F3、10μM反向外引物B3和10μM环引物LB。

4.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,还包含:pH=8.8的10×ThermoPol buffer、100mM MgSO4、10mM dNTPMix、8000U/mLBst DNAPolymeras和3mM HNB。

5.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的反应体系为10μL,包括:1μLpH=8.8的10×ThermoPol buffer、0.4μL浓度为100mM的MgSO4、1.4μL浓度为10mM each的dNTP Mix、0.4μL浓度为8000U/mL的Bst DNAPolymerase、0.6μL浓度为8000U/mL的HNB、1μL浓度为1‑10ng/μL的DNA模板、LAMP引物,双蒸水定容;

其中LAMP引物包括:0.12μL浓度为10μM的正向内引物FIP、0.12μL浓度为10μM的10μM反向内引物BIP、1.28μL浓度为10μM的10μM正向外引物F3、1.28μL浓度为10μM的反向外引物B3和0.64μL浓度为10μM的环引物LB。

6.一种基于LAMP快速检测有毒蘑菇日本红菇的方法,其特征在于,包括如下步骤:提取待测样品的基因组DNA,以提取的基因组DNA为DNA模板、如权利要求1所述的引物组合物为引物,进行LAMP反应。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述LAMP反应的体系为10μL,包括:1μLpH=8.8的10×ThermoPol buffer、0.4μL浓度为100mM的MgSO4、1.4μL浓度为10mM each的dNTP Mix、0.4μL浓度为8000U/mL的Bst DNAPolymerase、0.6μL浓度为8000U/mL的HNB、1μL浓度为1‑10ng/μL的DNA模板、LAMP引物,双蒸水定容;

其中LAMP引物包括:0.12μL浓度为10μM的正向内引物FIP、0.12μL浓度为10μM的10μM反向内引物BIP、1.28μL浓度为10μM的10μM正向外引物F3、1.28μL浓度为10μM的反向外引物B3和0.64μL浓度为10μM的环引物LB。

8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述LAMP反应的程序为:将反应试剂添加完成后加入石蜡油进行封层,离心混匀后60‑65℃水浴或金属浴30min~60min,然后在80℃以上孵育至少10min。

9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,终止LAMP反应后,根据反应液颜色变化判断检测结果,若反应液呈蓝色,则表示检测结果为阳性;若反应液呈紫色,则表示检测结果为阴性。

10.根据权利要求6‑9中任一项所述的方法,其特征在于,终止LAMP反应后,根据凝胶电泳平行实验是否检出阶梯型条带判断检测结果,若检测到阶梯型条带,则表示检测结果为阳性;若未检测到阶梯型条带,则表示检测结果为阴性。