1.一种不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，具体步骤如下：（一）制备线性化载体

对载体进行单酶切或双酶切，以使载体线性化；并回收、纯化酶切后的线性化载体；

所述载体为pTRV2或pRI101‑AN；

具体双酶切线性化时，采用EcoRI 、XhoI对pTRV2载体进行双酶切，采用NdeI、BamHI对pRI101‑AN载体进行双酶切；

（二）设计并合成两条部分互补的长链寡核苷酸序列设计并合成两条长链寡核苷酸片段Oligo F和Oligo R，两条长链寡核苷酸片段的序列的排列方式为：5’－载体同源序列＋酶切位点序列＋目的序列－3’；

其中，两条长链寡核苷酸片段序列的5’末端分别与所用线性化载体两端存在同源序列，两条长链寡核苷酸片段之间的3’末端目的序列存在部分互补序列；

目的序列的长度L=n1+n2‑（a1+b1）‑（a2+b2）‑c；

其中：n1、a1、b1分别为Oligo F的总长度、Oligo F与载体同源序列的长度、载体一端酶切位点的长度；

n2、a2、b2分别为Oligo R的总长度、Oligo R与载体同源序列的长度、载体另一端酶切位点的长度；

同时，a1≥15 nt，a2≥15 nt；

c为Oligo F和Oligo R互补序列长度，c≥15 nt，且Oligo F和Oligo R 的3’末端互补序列的Tm值应≥40℃；

（三）制备目的序列

对Oligo F、Oligo R进行退火处理；

（四）同源重组

将步骤（三）中退火后产物与步骤（一）中线性化载体进行单链重组；

（五）转化、筛选，获得重组载体

将步骤（四）中单链重组后产物进一步转化大肠杆菌并进一步进行筛选验证。

2.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，具体50 μL酶切体系及反应条件设计如下：pTRV2载体或pRI101‑AN载体，2000 ng；

内切酶1，2 μL；

内切酶2，2 μL；

10x Cut smart buffer，5 μL；

ddH2O，补足至50 μL；

37℃酶切过夜。

3.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，步骤（二）中，在pTRV2中引入SalI酶切位点时，序列设计如SEQ ID No.1 2所示，具体如下：~

Oligo F1：5’ ‑GTGAGTAAGGTTACCGAATTCACGGTACCCATATGGCTAGCGGATCCGAGCTCCGTCGAC ‑3’，Oligo R1：5’‑ GGGACATGCCCGGGCCTCGAGAGCGGCCGCTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGG ‑3’；

在载体pRI101‑AN中添加一个Myc蛋白标签时，序列设计如SEQ ID No.3 4所示，具体如~下：

Oligo F2：5’ ‑TCTTCACTGTTGATACATATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACC ‑3’，Oligo R2：5’ ‑GTTGATTCAGAATTCGGATCCTCAATGACCGGTCATATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG ‑3’；

在pRI101‑AN中添加Myc和His两个蛋白标签时，序列设计如SEQ ID No.5 6所示，具体~如下：

Oligo F3：

5’ ‑TCTTCACTGTTGATACATATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGACC ‑3’，Oligo R3：

5’ ‑GTTGATTCAGAATTCGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGATGACCGGTCATATTCAGATC ‑3’。

4.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，步骤（三）中，

10 μL反应体系设计如下：

Oligo F，10 μM、1 μL；

Oligo R，10 μM、1 μL；

ddH2O，8 μL；

反应条件：95℃，2 min；两条长链寡核苷酸序列的互补区域退火30 s，退火温度=两条长链寡核苷酸序列的互补区域的Tm值‑5℃。

5.如权利要求1所述不依赖PCR反应的短片段克隆方法，其特征在于，步骤（四）中，

10 μL重组反应体系设计如下：

步骤（一）中线性化的载体，添加量为0.01 ×载体碱基对数，ng；

步骤（三）中退火产物，1 μL；

5×重组酶缓冲液，2 μL；

重组酶，1 μL；

ddH2O，补足至10 μL

反应条件：37℃，30 min。