1.一种重组毕赤酵母工程菌,其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌是将SEQ ID NO.1所示基因Rihc-2、SEQ ID NO.2所示基因Hac1和SEQ ID NO.3所示基因PDI导入宿主菌构建获得的。
2.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌,其特征在于所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。
3.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌,其特征在于所述基因Rihc-2连接到质粒pPIC9K上,构建表达载体pPIC9K-Rihc-2,导入宿主菌。
4.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌,其特征在于所述基因Hac1连接到载体pPICZC中,构建表达载体pPICZC-Hac1,导入宿主菌;所述基因PDI连接到载体pPICZC中,构建表达载体pPICZC-PDI,导入宿主菌;
所述载体pPICZC按如下方法构建:以F7质粒为模板,利用引物Cre-F和Cre-R扩增Tcre基因片段;以pPICZα质粒为模板,利用引物Ori-Paox-F和Paox-R扩增Pox基因片段,利用引物Cre-Taox-F和Taox-R扩增Taox基因片段,利用引物Taox反向-R和Zeo反向-F扩增基因片段pP,利用引物ori-F和ori-R扩增基因片段Ori;以pPIC9K质粒为模板,利用引物Zeo-His4-F和引物His4-R扩增HIS4基因片段;将上述Tcre基因片段、Pox基因片段、Taox基因片段、基因片段pP、基因片段Ori和HIS4基因片段共6个片段连接,获得载体pPICZC;
5.如权利要求1所述重组毕赤酵母工程菌,其特征在于所述重组毕赤酵母工程菌按如下方法构建:将表达载体pPIC9K-Rihc-2电转入宿主菌中,筛选得到单拷贝腺苷水解酶基因的工程菌,利用转化后载体扩增方法获得多拷贝腺苷水解酶基因的工程菌;再利用抗性可循环表达载体技术将Hac1基因和PDI基因整合进基因组,得到重组毕赤酵母工程菌。
6.一种权利要求1所述重组毕赤酵母在制备嘌呤中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述应用方法为:以重组毕赤酵母经发酵培养获得的上清液浓缩后为催化剂,加入底物,以pH6.0-7.0的缓冲液为反应介质构成水解体系,在20-50℃下反应4~24h,反应液分离纯化,获得相应嘌呤;所述底物为腺苷或鸟苷。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述底物加入量以水解体系总体积计为100-
500g/L。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述发酵液按如下方法制备:将重组毕赤酵母接种至含BSM培养基的发酵罐中,调pH至5.0,温度为30℃,初始转速设置为500r/min,通气量控制溶氧在20%以上;当培养基中甘油消耗完后,溶氧快速上升,随即开始以10-50ml/h/L发酵液的速度流加含PTM1 12mL/L的体积浓度50%的甘油水溶液,培养至菌体含量为
150g/L;流加结束后,反应条件不变,饥饿30min后,第1-2h以3.6ml/h/L发酵液,第2-4h以
7.3ml/h/L发酵液,接着以10.9ml/h/L发酵液的速度流加含PTM1 12mL/L的无水甲醇进行诱导,使生长速率在0.001-0.1h-1,调节转速与通气量控制溶氧大于20%,发酵培养至菌体湿重达到400g/L时结束,获得含腺苷水解酶的发酵液;所述甘油水溶液体积加入量以BSM培养基体积计为200mL/3L;
所述BSM培养基:H3PO4 31.4mL/L,KOH 4.13g/L,K2SO4 18.2g/L,CaSO4 0.93g/L,MgSO47 H2O 14.9g/L,甘油40.0g/L,接种前用氨水调pH到5.0-5.5,并加4.35mL/L的PTM1;
PTM1配方:H3BO3 0.02g/L,CuSO4·5H2O 6.0g/L,MnSO4·H2O 3.0g/L,Na2MoO4·2H2O
0.2g/L,CoCl2 0.5g/L,NaI 0.08g/L,ZnCl2 20.0g/L,FeSO4·7 H2O 65.0g/L,生物素0.2g/L,5.0mL/L的H2SO4,ddH2O定容至1L。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于所述重组毕赤酵母在发酵前,先进行扩大培养,再以体积浓度10%接种量接种至BSM培养基,所述扩大培养是将重组毕赤酵母接种至YPD液体培养基,30℃培养24h;YPD液体培养基:酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L,溶剂为水,pH自然即可。