欢迎来到知嘟嘟! 联系电话:13336804447 卖家免费入驻,海量在线求购! 卖家免费入驻,海量在线求购!
知嘟嘟
我要发布
联系电话:13336804447
知嘟嘟经纪人
收藏
专利号: 2020101274150
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
价格&联系人
年费信息
委托购买

摘要:

权利要求书:

1.一种提高蛹虫草中虫草多糖含量的方法,其特征在于所述方法为:将过表达目的基因的蛹虫草重组菌接种至发酵培养基中,22~25℃,120~180rpm,摇床培养,获得含虫草多糖的发酵液;所述发酵培养基质量组成:2%葡萄糖,0.70%(NH4)2SO4,0.05%K2HPO4·3H2O,

0.05%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.10%L‑甘氨酸,溶剂为蒸馏水,pH自然;所述目的基因为葡萄糖激酶基因gk;

所述过表达目的基因的蛹虫草重组菌按如下方法制备:利用 ‑Uni Seamless Cloning and Assembly Kit将目的基因片段与载体PCAMBIA‑PgpdA‑Tcbh1‑hph‑PtrpC链接,得到重组载体PCAMBIA‑PgpdA‑gk‑Tcbh1‑hph‑PtrpC;将重组载体加入到大肠杆菌DH 5α感受态中,抽提质粒DNA,转化根癌农杆菌,获得含目的基因的农杆菌菌液;将无菌纤维素薄膜密贴合在共培养固体培养基表面,然后将蛹虫草孢子悬液与含目的基因的农杆菌菌液等体积混合,涂布于无菌纤维素薄膜上,24℃恒温避光共培养48h后,将混合菌液连同纤维素薄膜转移至选择培养基,纤维素薄膜紧密贴合无气泡,在贴合紧密的纤维素薄膜表面倒上一层选择培养基,完全覆盖纤维素薄膜,22~25℃恒温避光培养;取穿透上层选择培养基的菌丝转接至传代培养基中,22~25℃恒温避光培养3~4d,筛选获得过表达目的基因的蛹虫‑1草重组菌;所述共培养固体培养基为IM+200mmol·L 乙酰丁香酮;所述选择培养基是IM+‑1 ‑1 ‑1

200mg·L 潮霉素B+200mg·L 头孢菌素+100mg·L 卡那霉素;所述传代培养基是沙氏培‑1养基+200mg·L 潮霉素B。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述葡萄糖激酶基因gk核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6 8 ‑1

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述蛹虫草孢子悬液浓度为10~10·mL 。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述蛹虫草孢子悬液按如下方法制备:将蛹虫草(Cordyceps militaris)接种至PDA培养基,24℃恒温避光培养7日,然后于超净工作台上用无菌水反复冲洗PDA培养基表面,得到蛹虫草菌悬液,4层纱布过滤菌悬液除去菌丝体,得到蛹虫草孢子悬液。

5.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述含目的基因的农杆菌菌液OD600=0.80。

6.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述含目的基因的农杆菌菌液按如下方法制备:将目的基因的农杆菌划线接种至固体细菌培养基,28℃恒温培养48h,再挑取单菌落接种至液体细菌培养基,180rpm、28℃恒温培养36h,然后将其接种到农杆菌预培养液体培养基中,180rpm、28℃恒温培养6~8h至菌体浓度OD600=0.80,得到农杆菌菌液;所述固体细‑1 ‑1菌培养基是LB固体+25mg·L 利福平+50mg·L Kan卡那霉素;所述液体细菌培养基为LB液‑1 ‑1体+25mg·L 利福平+50mg·L 卡那霉素;所述农杆菌预培养液体培养基是IM+200mmol·L‑1乙酰丁香酮。

7.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL‑1。