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专利号: 202010067224X
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-12-18
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器,其特征在于,所述荧光化学传感器包括dsDNA底物、hAAG的环状模板和UDG的环状模板,其中dsDNA底物包含一个hAAG探针和一个UDG探针,hAAG探针含有一个次黄嘌呤碱基(I),UDG探针含有一个尿嘧啶碱基(U),两个探针的5'和3'端分别被生物素和NH2修饰,上述两个探针杂交形成hAAG和UDG的双功能dsDNA底物;hAAG和UDG能够特异性切割dsDNA底物,切割后的上述底物在APE1的催化下分别生成带有3'‑OH末端的hAAG引物和带有3'‑OH末端的UDG引物,以上引物可以分别与hAAG的环状模板和UDG的环状模板杂交并完成滚环扩增(RCA);

hAAG的环状模板由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)三种碱基组成,并且可以与上述hAAG引物杂交;UDG的环状模板由A,T和胞嘧啶(C)三种碱基组成,可以与上述UDG引物杂交。

2.如权利要求1所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器,其特征在于,所述荧光化学传感器还包括磁珠、核酸外切酶及荧光分子标记的dCTP和dGTP,脱氧核糖核苷酸dATP及dTTP。

3.如权利要求2所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器,其特征在于,所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠;或所述荧光分子标记的dCTP和dGTP为Cy3‑dCTP和Cy5‑dGTP。

4.权利要求1‑3任一项所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的荧光化学传感器和/或同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法在筛选人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶DNA糖基化酶抑制剂/激活剂中的应用;所述同时检测人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤:1)提供权利要求1中所述的dsDNA底物、hAAG的环状模板和UDG的环状模板;2)DNA糖基化酶诱导的切除反应和RCA反应,即将待测物加入到反应溶液中进行DNA糖基化酶诱导的切除反应,该反应溶液包含双功能dsDNA底物,NEB缓冲液4、UDG反应缓冲液和APE1酶;然后向反应液中添加所述hAAG的环状模板和UDG的环状模板、BSA、dATP、dTTP、Cy3标记的dCTP  (Cy3‑dCTP)、Cy5标记的dGTP (Cy5‑dGTP)、phi29反应缓冲液和phi29聚合酶,完成RCA反应并获得扩增产物;3)扩增产物与链霉亲和素包被的磁珠连接,即将上述扩增产物与链霉亲和素包被的磁珠(MBs)溶液混合,进行避光孵育、磁分离,获得扩增产物与磁珠的结合物(MB‑ssDNAs);4)核酸外切酶消化反应和荧光检测,即:核酸外切酶消化反应在含有MB‑ssDNAs、核酸外切酶III(Exo III)、核酸外切酶I(Exo I)、NEB缓冲液1和Exo I反应缓冲液的混合物中进行,分离磁珠,对上清中的荧光进行检测。