1.一种检测神经鞘氨醇葡萄糖苷和神经鞘氨醇半乳糖苷的多通道质谱衍生试剂,其特征在于,所述试剂的结构式如下:
;
所述X为CH3、CH2D、CHD2、13CD3、CD3、C2H5、C2H3D2、C2H2D3或C2D5。
2.一种如权利要求1所述的多通道质谱衍生试剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将100 mL乙腈和10.038 g 碳酸氢铵加到圆底烧瓶中,并在室温下搅拌1分钟,然后将1.5 g左氧氟沙星添加到该混合物中,并在室温下搅拌1分钟,随后,在3分钟内滴加48.6 mmol CH3I、CH2DI、CHD2I、13CD3I、CD3I、C2H5Br、C2H3D2I、C2H2D3I、C2D5I或C3H7Br,并将混合物在室温下搅拌180h,反应后,进行减压蒸馏,将得到的粉末在80 ℃下真空干燥,得产物;
(2)将1.0g产物溶于60 mL含1.6 g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 的氯仿中,在干燥条件下,缓慢加入40 ml含有5.3 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)盐酸二乙二酰亚胺(EDC•HCL) 的乙腈,并将圆底烧瓶用锡箔包裹,将混合物在室温下搅拌26小时,反应后,将其减压蒸馏,并从无水乙醇中重结晶,得到淡黄色的衍生试剂CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5/C3H7-ALSF。
3.一种如权利要求1或 2所述的多通道质谱衍生试剂用于检测神经鞘氨醇葡萄糖苷和神经鞘氨醇半乳糖苷的方法,其特征在于,包括以下步骤:首先使用CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-哌嗪-左氧氟沙星-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯(CH3/CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF)作为质谱衍生试剂,其中选择CH3-ALSF与GlcS和GalS的衍生物用作内标,选择CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF分别衍生8份生物样本,选择 C3H7-哌嗪-左氧氟沙星-N-羟基琥珀酰亚胺甲酸酯(C3H7-ALSF)-GlcS用作虚拟模板合成虚拟表面磁性分子印迹聚合物(DMMIPs)用于内标及待测样品混合液中GlcS和GalS衍生物的选择性萃取,利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱对待测样品中的GlcS和GalS的同时分离与定量分析。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
a. 衍生反应过程:将50 μL标准品混合溶液和8份等体积的标准品混合溶液或待测样品分别添加到装有200-350 μL pH 8.4-9.5的H3BO3-Na2B4O7缓冲液的离心管中,将200-300 μL CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF-分散剂溶液分别添加到8份等体积的标准品混合溶液或生物样本中组成待测物溶液,将200-300 μL CH3-ALSF-分散剂溶液添加到混合标准品溶液中组成内标物混合溶液,摇匀后密封,进行衍生反应,将200-300 μL的
50%甲酸溶液添加到每个试管中,衍生反应结束后,将CH3-ALSF衍生的标准品混合溶液和CH2D/CHD2/13CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF衍生的标准品混合溶液或待测样品在
10.0 mL离心管中等体积混合,即得到内标物和待测物混合溶液;
b.磁固相萃取过程:向内标物和待测物混合溶液加入8-12 mg DMMIPs,用200-300 μL,pH 8.8的H3BO3-Na2B4O7缓冲液调节溶液pH值为8.3-9.2;
剧烈摇动溶液5-15分钟以达到吸附平衡,最后,用外部磁铁分离DMMIPs(15-30 s),并用200-300 µL的洗脱剂洗脱1-3分钟,过滤洗脱液,并将其用乙腈定容至200 µL,得到萃取后的内标物和待测物混合溶液;
c. 将步骤b中的萃取后的内标物和待测物混合溶液经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述50 μL混合标准品溶液是由25 μL浓度-8 -8
为2×10 mol/L的GlcS和25 μL浓度为 2×10 mol/L 的GalS组成;所述的洗脱剂为体积为1:1的甲醇/水、乙醇/水、乙腈/水 、丙酮/水溶液,以及分别含有0.01%、0.05%、0.15%、
0.20%甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液;所述的分散剂为丙酮,乙腈,甲醇或乙醇;优化的,所述洗脱剂为含有0.01%甲酸的体积为1:1的甲醇/水溶液;所述分散剂为乙腈。
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6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,步骤(a)中,所述CH3 /CH2D/CHD2/ CD3/CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-ALSF-分散剂溶液的摩尔浓度为2.5×10-8 mol/L;所述衍生反应为在水浴45-55 ℃中超声波振荡反应下进行2-5分钟。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法,其特征在于,所述DMMIPs采用以下方法制备而成:在剧烈搅拌下,将1.0g三氯化铁六水合物,2.0 g无水乙酸钠和6.5 g 1,6-己二胺依次分散在30 mL乙二醇中,将混合物在室温下连续搅拌直至混合物变为透明溶液,然后,将上述溶液转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中,并在200 ℃下反应24小时;将获得的产物用水和乙醇洗涤三次,然后在60 ℃下真空干燥24小时,将100 mg所得产物,200 mg 4-甲酰基苯硼酸和250 mg硼氢化钠在无水甲醇(25 mL)中超声处理20分钟,以获得均匀的分散溶液;将获得的均匀溶液在65 ℃下回流24小时,最后,将产物用水和甲醇洗涤三次,将获得的产物在真空烘箱中在60 ℃下干燥24小时;将50 mg的产物和0.42 mg的C3H7-ALSF与GlcS的衍生物依次分散在30 mL pH 8.0的磷酸盐缓冲液中,将混合物在25 ℃下搅拌1 h,然后用pH
8.0的磷酸缓冲液漂洗3次,将获得的均匀溶液在65 ℃下回流24小时,随后,将预产物溶解在10 mL的乙腈溶剂中,然后添加0.14 mg丙烯酰胺,并将混合物超声处理15.0 min,然后将混合物放入黑暗中12小时以形成预聚合溶液;在超声波振动15.0分钟下,将1.97 mg乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.1 mg偶氮二异丁腈均匀分散在预聚合溶液中;然后将溶液转移到含有
70 mL乙腈的三颈烧瓶中;在60 ℃下充入氮气并连续搅拌24小时;通过磁铁分离获得DMMIPs,并在索氏提取器中用含0.10%甲酸的体积为1:1的甲醇和 H2O溶液洗涤,直到在溶液中未检测到模板分子为止;最后,溶液用甲醇洗涤至中性,磁铁分离后在60 ℃下真空干燥24小时,所的固体即为DMMIPs。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的C3H7-ALSF与GlcS的衍生物C3H7-ALSF-GlcS采用以下方法制备而成:将0.5 mg GlcS溶于5 mL pH 8.8的H3BO3-Na2B4O7缓冲液中,在搅拌下将4 mg C3H7-ALSF与5 mL乙腈缓慢加入上述溶液中,在室温下连续搅拌2.5小时后,通过减压蒸馏除去乙腈,通过过滤获得黄色沉淀物,在乙醇/水中结晶后,获得为白色晶体的C3H7-ALSF-GlcS。
9.根据权利要求4-7任一项所述的方法,其特征在于,所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱:2.1 mm × 50 mm,1.8 µm,进样体积为2 µL,柱温30 ℃,采用梯度洗脱法。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述的梯度洗脱法,时间为2 min,流速为
0.2 mL/min,流动相A为10%乙腈水溶液含有0.1%甲酸,流动相B为乙腈含有0.1%甲酸,0 min流动相组成为50%A+50%B,0.5 min时22%A+78%B,1.5 min时8%A+92%B,1.6 min时2%A+98%B,
2.0 min时0%A+100%B;
所述的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测时的质谱的条件为:干燥气温度300 ℃,流速10 L/min,喷雾器气压40 psi,鞘气温度280 ℃,流速11 L/min,毛细管电压3.5 kV。