欢迎来到知嘟嘟! 联系电话:13336804447 卖家免费入驻,海量在线求购! 卖家免费入驻,海量在线求购!
知嘟嘟
我要发布
联系电话:13336804447
知嘟嘟经纪人
收藏
专利号: 201910773247X
申请人: 安徽师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2023-08-08
缴费截止日期: 暂无
价格&联系人
年费信息
委托购买

摘要:

权利要求书:

1.一种负载抗癌药物喜树碱的纳米药物载体的荧光免疫定量检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤:(1)制备CPT@PSIOAm(负载喜树碱的油胺枝接聚琥珀酰亚胺)的包被抗原;

(2)制备FITC标记的抗PSIOAm抗体;

(3)将CPT@PSIOAm包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中,封闭、加入不同浓度的CPT@PSIOAm标准品和FITC标记的抗PSIOAm抗体,建立直接竞争荧光免疫分析法定量检测CPT@PSIOAm;

(4)以CPT@PSIOAm标准品浓度的对数为横坐标,荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线得出线性方程,从而定量检测出CPT@PSIOAm的浓度。

2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)具体包括以下步骤:

(1-1)将PSIOAm(油胺枝接聚琥珀酰亚胺)、喜树碱(CPT)、聚乙烯-b-聚乙二醇溶解于三氯甲烷中,然后加入到氢氧化钠溶液中,超声反应之后,蒸发除去三氯甲烷,离心,将沉淀分散在PBS缓冲溶液中,得到水解后的CPT@PSIOAm-COO-半抗原溶液;

(1-2)向CPT@PSIOAm-COO-半抗原溶液中加入含有N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的PBS缓冲溶液反应10~20min,然后加入鸡卵清白蛋白,温育后,离心,所得沉淀分散于PBS缓冲液中,即可得到所述CPT@PSIOAm的包被抗原。

3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,步骤(1-1)中,所述PSIOAm、喜树碱、聚乙烯-b-聚乙二醇、三氯甲烷、氢氧化钠的用量之比为(10~60)mg:(0.5~2)mg:(0.5~2)mL:(2~16)mL;所述超声反应的条件为200~400W超声5~10min。

4.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(1-2)具体包括以下步骤:向

1mL CPT@PSIOAm-COO-半抗原溶液中加入1mL含有0.1~1mg的N-羟基琥珀酰亚胺和0.1~1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的PBS缓冲溶液,反应10~20min后,加入

1~10mg鸡卵清白蛋白,于25℃下温育2~4h,离心10~15min,取沉淀分散到3mL中性PBS缓冲液中,即可制得CPT@PSIOAm的包被抗原。

5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(2)具体包括以下步骤:将PSIOAm抗体溶液与异硫氰酸荧光素溶液混合,避光搅拌反应3~6h,反应结束后经透析、凝胶过滤法纯化,得到FITC标记的抗PSIOAm抗体。

6.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,所述PSIOAm抗体溶液为PSIOAm抗体溶解在0.01M pH7.1的PBS缓冲液中得到,其蛋白浓度为10~20mg/mL;所述异硫氰酸荧光素溶液为异硫氰酸荧光素溶于pH=9.6碳酸盐缓冲液中得到,其浓度为2mg/mL。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法,其特征在于,所述PSIOAm抗体溶液与异硫氰酸荧光素溶液的体积之比为10:1;所述凝胶过滤纯化的洗脱液为0.01M的pH 7.1的PBS缓冲溶液,流速为0.1~0.5mL/min。

8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(3)具体包括以下步骤:

(3-1)包被:用包被缓冲液将CPT@PSIOAm包被抗原稀释80倍,包被96孔酶标板,每孔100μL,4℃冰箱过夜;

(3-2)封闭:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次,每次3~5min,然后加入1wt%酪蛋白封闭,每孔200μL,37℃温育1~2h;PBST溶液洗涤的目的是洗去未被结合上的CPT@PSIOAm包被抗原;

(3-3)加样竞争:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次,每次3~5min,然后将50μL不同浓度的CPT@PSIOAm标准液和50μL FITC标记PSIOAm抗体提前混匀分梯度加入各孔中,37℃温育1~

2h,之后用洗涤液洗涤2~4次,每次3~5分钟并甩干;

(3-4)在酶标仪上测定各孔在激发波长为485nm、发射波长为525nm时的荧光强度。

9.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(4)中,所述标准曲线的线性方程为F=8116.6-311.7lgC,F为荧光强度,C为CPT@PSIOAm的浓度;相关系数R2=0.991,线性范围为0.12-1638.7ng/mL,检出限为0.04ng/mL。