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专利号: 2019105666219
申请人: 临沂大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种前列腺特异抗原的检测试剂盒,其特征在于,包括以下组分:PSA抗体,琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯,三(2-羧乙基)膦,巯基修饰的DNA1,巯基修饰的DNA2,发夹DNA H1,发夹DNA H2,发夹DNA H3,发夹DNA H4,信标MB和Mg2+;所述巯基修饰的DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述巯基修饰的DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述发夹DNA H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述发夹DNA H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述发夹DNA H3的核苷6酸序列如SEQ ID NO.5所示;所述发夹DNA H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述信标MB包含一个识别离子酶的rA碱基且修饰有FAM和BHQ基团。

2.根据权利要求1所述检测试剂盒,其特征在于,所述信标MB的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.一种前列腺特异抗原的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将PSA抗体和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯进行偶联反应2h后,过滤得处理后抗体;所述PSA抗体和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯的摩尔比为1:10~20;

(2)将巯基修饰的DNA1和巯基修饰的DNA2分别与三(2-羧乙基)膦进行羟基活化反应

1h,得处理后DNA1和处理后DNA2;所述巯基修饰的DNA1和巯基修饰的DNA2与三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:104;

(3)将所述处理后抗体分别与处理后DNA1和处理后DNA2在4℃孵育12h,得Ab1-DNA1和Ab2-DNA2;所述所述处理后抗体与处理后DNA1和处理后DNA2的体积比均为1:1;

(4)将所述Ab1-DNA1、Ab2-DNA2、PSA、发夹DNA H1和发夹DNA H2混合后37℃反应2h,得链替代反应产物;所述Ab1-DNA1、Ab2-DNA2、PSA、发夹DNA H1和发夹DNA H2的摩尔比为100:

100:100:10-3:10-3;

(5)将所述链替代反应产物与发夹DNA H3和发夹DNA H4混合后37℃反应1h,得杂交链;

所述发夹DNA H3和发夹DNA H4的摩尔比为300:10-3:10-3;

(6)将所述杂交链与分子信标MB、Mg2+混匀后37℃反应1h,荧光检测;

步骤(1)和步骤(2)之间并没有时间先后顺序限制。

4.根据权利要求3所述检测方法,其特征在于,步骤(1)所述反应在PBS缓冲溶液中进行,所述反应的温度为18~25℃。

5.根据权利要求3所述检测方法,其特征在于,步骤(1)所述过滤用滤膜的截留分子量为10000MW。

6.根据权利要求3所述检测方法,其特征在于,步骤(2)所述反应的温度为37℃。

7.根据权利要求3所述检测方法,其特征在于,步骤(3)所述孵育后,还包括利用截留分子量为100000MW的滤膜过滤,保留膜上物质,并利用PBS缓冲液洗涤三次。

8.根据权利要求3所述检测方法,其特征在于,步骤(3)得所述Ab1-DNA1和Ab2-DNA2后,还包括紫外吸收检测。

9.根据权利要求3所述检测方法,其特征在于,步骤(6)所述荧光检测为在520nm可见光下检测信号峰。

10.权利要求1或2所述检测试剂盒或权利要求3~9任一项所述检测方法在靶标抗原信号放大中的应用。