1.一种基于转录组测序开发的锦绣杜鹃EST-SSR引物对,在检测过程中使用15对引物,所述引物分别为:
2.根据权利要求1所述的锦绣杜鹃EST-SSR引物对,其特征在于,所述引物对退火温度为:
3.权利要求1或2所述的锦绣杜鹃EST-SSR引物对的下述A1-A6中的任一种用途:A1、所述EST-SSR引物对在构建锦绣杜鹃遗传图谱中的应用;
A2、所述EST-SSR引物对在锦绣杜鹃种质鉴定中的应用;
A3、所述EST-SSR引物对在锦绣杜鹃育种中的应用;
A4、所述EST-SSR引物对在锦绣杜鹃遗传多样性分析中的应用;
A5、所述EST-SSR引物对在锦绣杜鹃亲缘关系分析中的应用;
A6、所述EST-SSR引物对在锦绣杜鹃分子标记辅助育种中的应用。
4.一种鉴定锦绣杜鹃亲缘关系和遗传特性的试剂盒,包括权利要求1或2所述的15对EST-SSR引物。
5.一种基于转录组测序开发锦绣杜鹃EST-SSR引物的方法,其特征在于,包括:(1)选取锦绣杜鹃盛花期新鲜花材料,获取后用锡箔纸包裹置于液氮中速冻并迅速转移至-70度冰箱保存;采用高盐Trizol试剂和RNA结合柱的方法提取总RNA;
(2)利用链特异性转录组文库构建试剂盒对总RNA先进行mRNA磁珠富集;将富集到的mRNA进行双链cDNA合成、末端修复和接头连接;再用USER酶降解cDNA第二链,保留真实转录的mRNA第一链信息;经PCR扩增和2%的琼脂糖凝胶电泳,回收300-500bp范围的片段,即得到测序文库;再利用Illumina Hiseq2500 PE125进行高通量RNA-seq测序;
(3)采用FASTX和CUTADAPT软件过滤数据,并采用Cufflinks软件进行数据组装得到Unigene,将其作为后续SSR引物开发的背景数据;
(4)使用MISA软件对Unigene进行SSR位点搜索,搜索标准为:二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸最少重复次数分别为10次、8次、6次、5次、4次,筛选出符合SSR引物设计的序列;
(5)利用primer 3.0软件对含有EST-SSR位点且侧翼序列大于50bp的Unigene序列进行引物设计,引物退火温度50-65℃之间,PCR产物大小100-300bp,引物长度18-24nt之间,CG含量40%-60%,避免引物产生二聚体结构、发夹结构和引物错配;
(6)挑选合成步骤(5)设计的EST-SSR引物对,对锦绣杜鹃种群进行PCR扩增和6%PAGE凝胶电泳检测,验证EST-SSR引物对的有效性;将多态性引物用于黄杜鹃等3个近缘种的跨物种扩增研究中,验证其通用性。
6.一种鉴定植物样品基因型的方法,其特征在于,包括:
(1)提取所述植物样品的DNA;
(2)用选自权利要求1或2的至少一个引物对扩增至少一种EST-SSR标记;
(3)鉴定所述植物样品中的至少一种多态等位基因;
所述植物选自锦绣杜鹃、黄杜鹃、云锦杜鹃、映山红。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)包括用对应引物对扩增2种或更多EST-SSR标记。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)包括用对应引物对扩增15种EST-SSR标记。
9.由权利要求1或2所述的引物对以锦绣杜鹃、黄杜鹃、云锦杜鹃、映山红的基因组为模板扩增得到的分离的EST-SSR标记。