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专利号: 2018108847175
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)预处理:制作并固定待测菌株的DNA;

(2)杂交:将待测菌株的DNA与标记单链DNA探针进行杂交作用;

(3)筛选:通过特异性检测待测菌株是否产生鳍藻毒素;

其中,步骤(2)中,所述标记单链DNA探针为利用经地高辛标记的含有182个碱基的序列

1所述的单链DNA探针,所述序列1为:

TGACCCTGTGACACCGACCGACCTCCGACCGACCCTCGACCCTTAGCCTGGTCCTCTTGACTGGACTAGGCCGACCGAACCTCGTCACTCGACCTAGCCCTCCTGGACTGTTCCTACGAATATCTGACCGATGGCGACCTCCTACGCCGCTTCGCGACTCCTCTGGCGCCGACCCCGACTCC。

2.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,所述标记单链DNA探针由特定的正向引物pks I-a和反向引物pks I-b,经聚合酶链式反应扩增后,经地高辛标记后获得。

3.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,所述正向引物pks I-a的序列为:GGATACGCAGAGTTGTAGAG;所述反向引物pks I-b的序列为:AGCTCGATCACTTGTATGC。

4.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,步骤(1)中预处理工艺为:取待测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜,浸于0.45~0.52M NaOH溶液8~12分钟,于78~80℃条件下烘1~2个小时固定DNA;在TE缓冲液中加入溶菌酶,放入DNA膜,于35~38℃温浴20分钟后,用TE缓冲液冲漂洗。

5.根据权利要求4所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,步骤(1)中:所述溶菌酶的添加量为每毫升TE缓冲液加入4~6mg/mL溶菌酶;pH为7.5~8.0。

6.根据权利要求4或5所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,步骤(2)中杂交工艺为:将经过步骤(1)预处理过的DNA膜置于8~10mL杂交缓冲液中,40~42℃温育40~45分钟;将标记单链DNA探针置于沸水8~12分钟后,置于冰浴中,取4~6mL标记单链DNA探针加入1~2mL杂交缓冲液中;将DNA膜取出置于塑料薄膜上,加入含标记单链DNA探针的杂交缓冲液中,于40~45℃下作用45~50分钟后,放置盛有2x SSC溶液的平皿内,洗涤1~2次.每次4~5分钟。

7.根据权利要求6所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,步骤(3)中筛选工艺为:将经过步骤(2)处理过的DNA膜放至盛有缓冲液的平皿中洗1分钟;

弃去洗涤液,加入25mL 1%封闭液,室温放置60分钟;弃去封闭液,加入20mL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液,37℃温育25分钟,弃去抗体结合物,用冲洗液洗涤3次,每次35mL;在显色缓冲液中平衡2分钟后,倾倒显色液;将DNA膜置于塑料袋内.加入BCIP/NBT显色液中,置于暗处,待显色后加入TE溶液终止反应;有斑点出现表示结果阳性,无斑点,即表示结果阴性。

8.根据权利要求6所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述杂交缓冲液为:2×SSC溶液,48~50mM磷酸缓冲液,0.8~1mM EDTA,8~

12%硫酸葡聚糖,48~50%去离子甲酰胺;pH为7.0~7.1。

9.根据权利要求7所述的一种快速筛选产生鳍藻毒素微生物菌株的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述缓冲液为:0.1M顺丁烯二酸,0.15M NaCl;pH为7.0~7.5。