1.一种检测肼的比率式荧光探针的制备方法，其特征在于，采用以下步骤进行制备：

（1）将三氯氧磷溶于二氯甲烷中混合均匀后，滴入无水N,N-二甲基酰胺和二氯甲烷混合溶液中，滴加完毕后，再加入环己酮反应得到化合物1；

（2）将苯并吲哚与碘乙烷溶于乙腈中反应得到化合物2；

（3）将步骤（1）制备的化合物1与将步骤（2）制备的化合物2以甲苯与正丁醇混合溶剂为溶剂，加热回流得到荧光探针化合物3；

（4）将步骤（3）制备的化合物3溶于无水N,N-二甲基酰胺中, 加入乙酸钠在氮气条件下反应生成化合物4；

（5）将步骤（4）生成的化合物4溶于无水二氯甲烷中，加入乙酰氯，在冰浴中滴加三乙胺后在氮气保护下常温反应4小时生成检测肼的比率式荧光探针；

步骤（5）生成检测肼的比率式荧光探针的结构为 。

2.根据权利要求1所述的检测肼的比率式荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤具体的操作方法为：（1）将40mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶于 40mL二氯甲烷, 倒入夹套瓶中-10℃冷却并搅拌 20 min得到混合溶液1；将27-47mL三氯氧磷溶于35mL二氯甲烷中，混合均匀后倒入恒压漏斗中, 缓慢滴加到混合溶液1中不断搅拌；滴加完毕后，加入 8-12g环己酮，溶液变为亮黄色时恢复到室温，然后缓慢加热至40℃，加热回流3h；回流结束后将反应液快速加入装有碎冰的烧杯中，冷却到室温后用二氯甲烷萃取，旋蒸得化合物1；

（2）将30ml-70ml的苯并吲哚和30mL-70mL的碘乙烷加入到500mL的三口烧瓶中，加入

200mL乙腈，加热回流24h；冷却至室温后过滤，过滤沉淀物经石油醚洗涤后放置于烧杯中，沉淀物晾干得化合物2；

（3）将步骤（1）制备的化合物1与步骤（2）制备的化合物2加入到100 mL甲苯-正丁醇混合溶剂中充分溶解，化合物1的溶解浓度为0.017g/mL  , 化合物2的溶解浓度为0.037g/mL，除去反应过程中产生的水，加热回流 3-5h，停止反应后溶液在旋转蒸发仪上浓缩旋干；粗产品柱层析色谱进行纯化，洗脱剂选择乙酸乙酯：甲醇＝8:1. (V/V)，得化合物3其中所述的甲苯-正丁醇混合溶剂中甲苯和正丁醇的体积比为3:7；

（4）将步骤（3）制备的化合物3溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺中, 溶解浓度0.025g/mL, 然后加入乙酸钠, 乙酸钠溶解浓度0.006 g/mL；将混合物在60℃-90℃下在氮气保护下过夜反应，然后冷却至室温并用二氯甲烷萃取，反复萃取4-5次，用饱和的碘化钾水溶液洗涤3次后，混合物用无水硫酸钠干燥，然后过滤，滤液真空干燥后进行柱层析,用体积比为从1:0～14:1的二氯甲烷-甲醇体系洗脱剂梯度洗脱，得化合物4；

（5）将步骤（4）制备的化合物4溶于无水二氯甲烷溶液, 溶解浓度0.015g/mL，加入乙酰氯，乙酰氯浓度为0.005g/mL，在氮气保护下在冰浴中滴加三乙胺，三乙胺浓度为0.001g/mL，所得混合物室温搅拌4-6小时，反应完成后，将产物真空干燥后进行柱层析，用体积比为从1:0～4:1的乙酸乙酯-甲醇体系洗脱剂梯度洗脱，得到产物即为检测肼的比率式荧光分子探针。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述检测肼的比率式荧光分子探针的效果判断指标如下：检测灵敏度：检测限15.2nmol/L；

检测响应倍率：荧光探针在 825nm处的荧光强度明显地降低，在662nm处的荧光强度显著增加；

颜色变化：日光灯下表现为由绿色变为红色；

光学机理指标：π电子体系的重排检测肼的比率式荧光分子探针。

4.一种权利要求1或2所述的方法制备得到的检测肼的比率式荧光分子探针的应用，其特征在于：适用于生物样本中肼的定性或定量分析；其中所述生物样本为活细胞、活体和生命有机分析化学中的一种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于： 所述检测肼的比率式荧光分子探针定量分析生物样本中肼时，适用于检测水样中肼的量；定性检测生物样本中肼时，适用于在活细胞或活体内肼的检测。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述检测水样中肼含量的方法，步骤包括：

1）配制溶液

探针储备液：准确称取检测肼的比率式荧光分子探针溶于醋酸盐缓冲液和DMSO，配制为浓度50μM的探针储备液；所述醋酸盐缓冲液的pH为 4.5，浓度为10mM；醋酸盐缓冲液和DMSO的体积比为1:9；

肼储备液：准确称取0.00032g肼溶于10mL去离子水中，配制为浓度1000μM的肼储备液；

2）建立水样-肼标准品的线性方程

将步骤1）配制的肼储备液用蒸馏水稀释得到梯度浓度为0～100μM的肼标准溶液，然后分别取100μL肼标准溶液与100μL步骤1）配制的探针储备液和650μL去离子水储备液混合后，加入50μL浓度为10 mM、 pH 4.5的醋酸盐缓冲液，充分振荡，使体系混合均匀，在25℃下放置60min，然后经荧光分光光度计检测，建立水样-肼浓度与荧光信号强度的线性方程；

 3）荧光检测待测水样中肼的含量

将1000μL待测样品加入到石英比色皿后，在荧光检测仪内进行扫描检测，收集荧光发射位置的强度数据代入水样-肼浓度与荧光信号强度的线性方程，计算得待测水样中肼含量。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：检测待测水样品时，以荧光检测的方法对待测物进行平行检测，用肼标准品溶液进行校准，得到荧光检测的检测范围，根据不同样品所含待测物的浓度范围来选择荧光检测手段进行定量。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：荧光检测范围为0-100μM。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述活细胞内肼的检测方法为：将待测活细胞样品在培养基中培育18～26h，待测活细胞接种量为2×107～9×107个/mL，加入检测肼的比率式荧光分子探针，探针浓度为5μM，分别加入0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM的N2H4，根据所测得荧光探针的荧光发射，选择激发发射波长，在共聚焦激光扫描显微镜上来获取细胞的荧光图像，根据发光情况判断活细胞中是否能用探针检测肼，判断标准为：荧光在 825nm处的荧光强度明显地降低，而在662nm处的荧光强度显著增加。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的活细胞为肝癌细胞，培养基为DMEM培养基。

11. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：活体内肼的检测方法为：在醋酸盐缓冲液和DMSO混合物中给予小鼠腹腔注射25μL，50μM Cy7A和随后的腹腔注射25μL，500μM N2H4，在分别孵育0,0.5,1,1.5,2和2.5小时后拍摄图像，根据发光情况判断在活体中是否能用探针检测肼，判断标准为：随着时间的增加，荧光在通道1处的荧光强度明显地降低，而在通道

2处的荧光强度显著增加；其中所述醋酸盐缓冲液的pH为 4.5，浓度为10mM；醋酸盐缓冲液和DMSO混合物中醋酸盐缓冲液和DMSO的体积比为1:9；所述通道1：760-840 nm，λex=740nm；

通道2：600-700 nm，λex= 530nm。