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专利号: 2017104893362
申请人: 安徽师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2023-12-08
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种PSI-OAm-NAPI两亲聚合纳米材料的定量检测方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:a、水解PSI-OAm-NAPI,得到水解后的MFAP溶液;

b、制备MFAP的免疫抗原和包被抗原;

c、制备MFAP抗体;

d、将MFAP包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中,封闭、加入不同浓度的MFAP标准液,以MFAP抗体作为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗,进行间接竞争酶联免疫分析法;

e、以MFAP标准液浓度的对数为横坐标,吸光度值为纵坐标建立标准曲线,从而定量检测出MFAP的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述标准曲线的线性方程为:A=0.951-4

0.104lgC,相关系数R=-0.999,线性范围为0.82~6.31×10ng/mL,检出限为0.057ng/mL;

其中,A为490nm处吸光度值,C为MFAP的浓度。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤a具体包括以下步骤:将PSI-OAm-NAPI纳米粒子与聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)溶解于三氯甲烷溶液中,加入新配置的氢氧化钠溶液超声,蒸发除去三氯甲烷;最后经过离心取沉淀分散于PBS中得到水解后的MFAP溶液。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤a具体包括以下步骤:将40~80mg PSI-OAm-NAPI纳米粒子与0.4~0.8mg聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)溶解于

1~6mL三氯甲烷溶液中,加入8~16mL浓度为0.002~0.008mg/mL新配置的氢氧化钠溶液超声,50~60℃蒸发除去三氯甲烷;最后经过离心取沉淀分散于PBS溶液中得到水解后的MFAP溶液。

5.根据权利要求3或4所述的方法,其特征在于,所述水解后的MFAP溶液的浓度为2~

10mg/mL。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤b具体包括以下步骤:b-1、将N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和牛血清白蛋白加入到水解后的MFAP溶液中,18~29℃温育2~6小时后离心分离,将沉淀分散到中性PBS缓冲液中得到免疫抗原溶液,将溶液装入透析袋中,放入PBS缓冲溶液中透析过夜,即可制得MFAP的免疫抗原;

b-2、将步骤b-1中的牛血清白蛋白替换为鸡卵清白蛋白,其他条件保持不变,即可制得MFAP的包被抗原。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤b具体包括以下步骤:b-1、向2mL步骤a得到的水解后的MFAP溶液中加入包含有0.2~2mg的N-羟基琥珀酰亚胺和0.2~2mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的2mLPBS缓冲溶液,震荡反应20~30min后加入2~10mg牛血清白蛋白,于25℃下反应2~4h,之后于离心机12000~

20000r/min离心10~15min,取沉淀分散到PBS缓冲液中,得到免疫抗原溶液,将溶液装入透析袋中,放入PBS缓冲溶液中透析过夜,即可制得MFAP的免疫抗原,其浓度为1~5mg/mL;

b-2、将步骤b-1中的牛血清白蛋白替换为鸡卵清白蛋白,其他条件保持不变,即可制得MFAP的包被抗原,其浓度为1~5mg/mL。

8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤c具体包括以下步骤:c-1、首次免疫:将MFAP免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合后,背部皮下多点注射到动物体内,注射8~10个点,注射量为0.5~1.0mg/kg/次;首次免疫三周后进行加强免疫;

c-2、加强免疫:将MFAP免疫原与福氏不完全佐剂等体积比混合后,采取同样的方式注射到动物体内,注射量为0.5~1.0mg/kg/次;此后每两周再进行一次加强免疫,期间采血测效价,直到抗体效价达到1:64000,一周后心脏采血,纯化得到MFAP抗体。

9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤d具体包括以下步骤:d-1、将MFAP包被抗原溶液用碳酸盐缓冲液稀释到2~10μg/mL包被96孔酶标板,以80~

150μL/孔的量包被并于4℃冰箱内培养过夜;之后用PBST洗涤液洗涤酶标板2~5次,每次3~6min最后一次需拍干;

d-2、加入质量分数1%~5%酪蛋白封闭液,200~250μL/孔,37℃温育1.5~2h;之后用PBST洗涤液洗涤酶标板2~5次,每次3~6min最后一次需拍干;

d-3、每孔加入40~60μL不同浓度的MFAP标准液和40~60μL1~5μg/mL的MFAP抗体,37℃温育2~4h;之后用PBST洗涤液洗涤酶标板2~5次,每次3~6min最后一次需拍干;

d-4、加酶:每孔加入80~150μL经PBS稀释后的稀释比为1:5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体,37℃温育2~4h;之后用PBST洗涤液洗涤酶标板2~5次,每次3~6min最后一次需拍干;

d-5:显色:每孔加入50~100μL邻苯二胺底物液进行显色反应,37℃显色15~45min;

d-6、终止:每孔加入50~100μL H2SO4终止反应,在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值。