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专利号: 2017103716159
申请人: 青岛科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-03-22
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种非诊断目的的化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法,其特征在于以鲁米诺还原氯金酸,得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs,以适体互补序列DNA修饰LumAuNPs,得化学发光探针;以磁珠为载体固定适体DNA,得适体DNA修饰磁珠;再将化学发光探针与适体DNA修饰磁珠孵育得化学发光传感器;在目标物糖化血红蛋白存在时,适体DNA与糖化血红蛋白作用,化学发光探针从磁珠表面脱落;经过磁分离后,在分离液中加入羟胺-O-磺酸,以LumAuNPs—羟胺-O-磺酸为化学发光体系,进行化学发光测定,根据产生的化学发光实现目标糖化血红蛋白的测定,具体步骤:(1)鲁米诺胶体金纳米粒子的制备:实验开始前,将所用的玻璃仪器用HNO3/HCl体积比为3:1的王水浸泡24h后,用二次蒸馏水冲洗,放入烘箱烘干;取一定量的1%的氯金酸溶液加去离子水稀释成0.02%的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中,在磁力搅拌下加热回流煮沸;

待溶液沸腾后,快速加入0.01mL~5mL 0.01M的鲁米诺溶液,继续加热煮沸,溶液的颜色由浅黄色变为黑色,最后变成酒红色,40min后停止加热,并在继续搅拌下冷却至室温,得鲁米诺胶体金纳米粒子,即LumAuNPs,将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中,4℃下保存备用;

(2)适体DNA修饰磁珠的制备:取10μL~100μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中,用

10μL~200μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次,然后分散到0.01mL~2mL含有0.1M EDC和

0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中,在37℃条件下,振荡反应30min;然后向离心管中加入10μL~200μL浓度为5.0×10-8M适体DNA,在37℃条件下振荡过夜,得到适体DNA修饰磁珠,然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次,最后分散到2.0mL PBS缓冲溶液中,4℃保存;

(3)适体互补序列DNA修饰LumAuNPs的制备:将1μL~20μL的TCEP加到10μL~200μL浓度为1.0×10-6M的适体互补序列DNA溶液中,37℃振荡活化1小时,再取100μL~1000μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中,在37℃条件下震荡过夜,然后再加入10μL~200μL含0.3M NaCl pH 8.2的10mM Tris-HCl缓冲液;继续震荡48h后,在12000rpm的条件下离心30min后,将红色沉淀用1mL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗,再次离心,如此重复三次,得适体互补序列DNA修饰LumAuNPs,即化学发光探针;最后得到的化学发光探针分散到1000μLpH 7.4的

0.1M PBS缓冲溶液中,4℃保存备用;

(4)糖化血红蛋白的检测:取10μL~200μL适体DNA修饰磁珠溶液置于离心管中,然后在此离心管中加入10μL~100μL化学发光探针溶液,37℃条件下震荡反应40min后,磁分离,将磁性分离物分散在10μL~100μL含目标物糖化血红蛋白的溶液中,37℃震荡反应40min,经过磁分离后,将磁性分离液分散在50μLpH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中,然后再加入羟胺-O-磺酸溶液,产生化学发光,根据化学发光强度定量,实现糖化血红蛋白的测定;

所述的DNA序列如下:

适体DNA为:5`-NH2-ACACAGCAACACACCCACCCACCAGCCCCAGCATCATGCCCATCCGTCGTGTGTG-3`;

适体互补序列DNA为:5’-SH-CACACACGACGGATGGGCATGATGCTGGGGCTGGTGGGTGGGTGTGTTGCTGTGT-3’。