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专利号: 2017101663369
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-04-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶诱导的胸腺嘧啶切除修复:双链DNA底物中加入待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸和DNA聚合酶;所述双链DNA其中一条为环形模板DNA,另一条为线性探针,所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物;杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶;通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N-糖苷键,从而剪切掉线性DNA探针上错配的胸腺嘧啶,产生一个脱碱基位点;然后核酸内切酶Ⅳ将对脱碱基位点进行剪切,从而导致线性探针3’端部分序列的断裂;

(2)尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增:在脱氧腺苷三磷酸,脱氧鸟苷三磷酸,脱氧胞苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸和聚合酶存在条件下,被切断的线性探针作为引物引发滚环扩增反应,产生包含尿嘧啶核苷酸的长片段重复序列;而后在尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶Ⅳ协助下,尿嘧啶被特异性切除,同时产生一个带羟基的3’末端以确保新的聚合延伸的循环;持续的聚合和尿嘧啶切除过程导致大量报告序列的生成;产生的报告序列随后与剩余的环形模板DNA结合以引发新一轮的聚合和尿嘧啶切除反应循环,最终生成大量报告序列;

(3)核酸内切酶Ⅳ介导的信号探针循环切割以及荧光分子的释放:加入信号探针,所述信号探针为荧光标记探针,所述信号探针上设计有且仅有一个四氢呋喃的无嘧啶位点,所述信号探针与报告序列结合,引发核酸内切酶Ⅳ介导的信号探针上的四氢呋喃的无嘧啶位点的循环切割,最终产生放大的荧光信号,对荧光信号进行检测,定量分析胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性。

2.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述线性探针的长度为32nt,所述线性探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’,其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶,X为2',3'-二脱氧胞苷。

3.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接,外切酶消化,纯化后所得;

其中,所述线性锁式探针的长度为57nt,所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTG TCG CGT TGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’;所述碱基序列中5’端的P为修饰的磷酸基团;

所述连接探针的长度为17nt,所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAG CG-3’;

所述信号探针的长度为26nt,所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT-FAM-TCC CXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’,其中FAM为荧光报告基团,BHQ1为荧光淬灭基团;X代表四氢呋喃无碱基位点。

4.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

5.如权利要求1所述的检测方法,其特征在于,采用荧光分光光度计对荧光信号进行检测分析。

6.一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:双链DNA底物,核酸内切酶IV(Endo IV)、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸、DNA聚合酶、信号探针,其中所述双链DNA其中一条为环形模板DNA,另一条为线性探针,所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物;杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶。

7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述线性探针的长度为32nt,所述线性探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAG TGC AAC GAA GAA AAA AX-3’,其中T为所述线性探针中的错配碱基胸腺嘧啶;X为2',3'-二脱氧胞苷;

所述环形模板DNA由线性锁式探针和连接探针经过连接酶连接,外切酶消化,纯化后所得;

所述线性锁式探针的长度为57nt,所述线性锁式探针的碱基序列为5’-P-CTG TCG CGT TGC TTC GAT TGC TGC GTC CCT TCC CGC CCT GCC CTT CTC TTC CGC CCG-3’;所述碱基序列中5’端的P为修饰的磷酸基团;

所述连接探针的长度为17nt,所述连接探针的碱基序列为5’-GAA GGC GGG CGA CAG CG-3’;

所述信号探针的长度为26nt,所述信号探针的碱基序为5’-TGC TGC GTC CCT-FAM-TCC CXC CCT-BHQ1-GCC CT-3’,其中FAM为荧光报告基团,BHQ1为荧光淬灭基团;X代表四氢呋喃无碱基位点;

所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

8.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括细胞裂解缓冲液,所述细胞裂解缓冲液包括pH为8.0的10毫摩尔Tris-HCl,150毫摩尔每升的氯化钠,1%的质量体积比的乙基苯基聚乙二醇,0.25毫摩尔每升的脱氧胆酸钠,1%的质量体积比的甘油,0.1毫摩尔每升的4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐。

9.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括所述胸腺嘧啶DNA糖基化酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV和DNA聚合酶的缓冲体系。

10.权利要求6-9任一项所述试剂盒在检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶中的用途。