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专利号: 2016107490250
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种亲和配基,其特征在于:亲和配基的构建是在对NpuDnaE-N,即IN的结构进行改造的基础上进行的,改造后的IN片段命名为IN*;其中,天然IN的C端添加一个半胱氨酸,用于与层析微球的共价结合;

天然IN的N端首位氨基酸引入突变Cys1Ala,避免N端断裂反应的发生;

His-tag置于天然IN片段的N端,用于纯化配基片段。

2.根据权利要求1所述的亲和配基,其特征在于:所述天然NpuDnaE基因序列模板如序列表SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求2所述的亲和配基,其特征在于:所述His-tag置于天然IN片段的N端,突变Cys1Ala,天然IN的C端添加一个半胱氨酸,其基因序列如序列表SEQ ID No.4所示,其蛋白质序列如序列表SEQ ID No.6所示。

4.一种如权利要求1~3任一所述的亲和配基的构建方法,其特征在于:对天然断裂型*内含肽NpuDnaE的N端剪接结构域进行分子改造,改造后的IN片段命名为IN,包括,在天然IN的C端添加一个Cys;

在IN片段的N端添加His-tag序列;

在引物中添加Nde I、Hind III两个酶切位点并利用其将IN*片段插入表达载体pET28a,获得的蛋白即为亲和配基片段。

5.根据权利要求4所述的亲和配基的构建方法,其特征在于:所述引物,其中,IN*序列改造的上、下游引物基因序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求4或5所述的亲和配基的构建方法,其特征在于:还包括,重组菌的构建,以pRSFDuet-1-NpuDnaE质粒为模板进行PCR,获得改造后的片段IN*,利用载体pMD19-T构建重组质粒pMD19-T-IN*,转化感受态E.coli JM109,然后利用Nde I和Hind III两个酶切位点将构建好的IN*序列与表达质粒pET-21b进行酶切连接,得到重组表达质粒pET-21b-IN*,最后转化感受态E.coli BL21(DE3),得到改造后的重组IN*表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-21b-IN*;

NpuDnaEIN*的表达纯化,对重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-21b-IN*进行诱导表达,获得改造后的重组IN*蛋白。

7.根据权利要求6所述的亲和配基的构建方法,其特征在于:与重组IN*蛋白相配对的IC-GFP片段的基因序列和蛋白质序列如序列表SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示。

8.一种利用如权利要求1~3任一所述的亲和配基偶联得到的亲和层析介质,其特征在于:以IN*片段为亲和配基,通过活化中间臂共价偶联到琼脂糖微球,形成对IC融合蛋白具有亲和作用的亲和层析介质,其结构为琼脂糖微球-活化中间臂-IN*亲和配基:

9.一种如权利要求8所述的亲和层析介质的偶联制备方法,其特征在于:其方法包括,使用双环氧化合物1,4-丁二醇二缩水甘油醚对含有羟基的琼脂糖进行活化,得到含一长亲水链的活化环氧琼脂糖;

所述活化环氧琼脂糖上的环氧乙烷基团与IN*片段C端Cys的巯基反应,将亲和配基片段IN*与活化后的琼脂糖介质进行偶联得到亲和层析介质。

10.一种利用如权利要求8所述的亲和层析介质的应用,其特征在于:包括,将亲和层析介质装柱;

用含有1mmol/L Zn2+的PBS缓冲液进行平衡;

将含有目的蛋白的IC融合蛋白粗样进行上样;

用不含Zn2+的PBS缓冲液进行清洗;

用含有50mmol/L DTT的断裂缓冲液冲洗层析介质,室温下静置3h;

用洗脱缓冲液洗脱断裂后的目标蛋白并进行收集;

IN*亲和层析柱进行再生。