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专利号: 2015103553148
申请人: 湖北工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂,包括引物和探针,所述引物包括正向引物和反向引物,所述探针为肽核酸探针,其特征在于:所述检测Pygo2基因R46S突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.1;

所述检测Pygo2基因R46S突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.2;

所述检测Pygo2基因P98H突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.3;

所述检测Pygo2基因P98H突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.4;

所述检测Pygo2基因R334Q突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.5;

所述检测Pygo2基因R334Q突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.6;

所述检测Pygo2基因R356P突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.7;

所述检测Pygo2基因R356P突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.8;

所述检测Pygo2基因R46S突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.9;

所述检测Pygo2基因P98H突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.10;

所述检测Pygo2基因R334Q突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.11;

所述检测Pygo2基因R356P突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.12;

所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰,修饰所述

5'端的荧光报告基团为:FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,修饰所述3'端的淬灭基团为:TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

2.根据权利要求1所述的基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂,其特征在于:检测试剂还含有对比试剂,对比试剂为与Pygo2基因野生型互补的肽核酸序列,所述特异性结合包含Pygo2基因46密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.13;

所述特异性结合包含Pygo2基因98密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.14;

所述特异性结合包含Pygo2基因334密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.15;

所述特异性结合包含Pygo2基因356密码子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.16。

3.用权利要求1所述的基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂进行检测的方法,其特征在于:检测方法为PCR检测方法,所述PCR检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量PCR方法;

所述实时荧光定量PCR的反应体系为:正向引物、反向引物、DEPC水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、RNASIN、M-MLV逆转录酶、oligo(dT)和含Mg离子的溶液;

所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。

4.根据权利要求3所述的基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测方法,其特征在于:检测的步骤如下:

1)针对Pygo2基因46、98、334、356密码子突变型设计检测这些位点的引物及PNA探针;

2)针对Pygo2基因46、98、334、356密码子序列设计与这些位点野生型互补的4段PNA序列;

3)构建含有Pygo2基因突变型和野生型的质粒,并计算拷贝数,制成参考品;

4)提取待测细胞中mRNA;

5)用上述检测Pygo2基因突变试剂对参考品和样本进行荧光定量PCR检测,并判断Pygo2基因46、98、334、356密码子是否发生突变。

5.根据权利要求3所述的基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测方法,其特征在于,所述PCR反应液中所述Taq酶的终浓度为0.01U/μL~0.05U/μL,所述dNTPs的终浓度为0.2~0.6mM,所述10×PCR Buffer的终浓度为1×,所述RNASIN的终浓度为40U/μL~60U/μL,所述M-MLV逆转录酶的终浓度为200U/μL~320U/μL,所述MgCl2的终浓度为1.5~5.0mM,溶剂为DEPC水,所述正向引物的终浓度为0.05~0.9μM,所述反向引物的终浓度为0.05~0.9μM,所述荧光探针的终浓度为0.05~0.9μM。

6.根据权利要求3所述的基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测方法,其特征在于,所述实时荧光定量PCR的反应程序为:42℃逆转录20min;94℃预变性,

2min;95℃变性,30s;58℃,45s;进行40个循环。

7.权利要求1所述的基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Pygo2基因突变的检测试剂的应用,其特征在于:用于制备检测肿瘤细胞及正常细胞的检测试剂,所述癌细胞为膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、肺腺癌细胞或急性骨髓性白血病血细胞。