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专利号: 2015101175633
申请人: 浙江海洋学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2025-04-21
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽,其特征在于该铁螯合肽的氨基酸序列为Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met,ESI/MS测定分子量为1045.18 Da。

2.一种权利要求1所述的一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

1)带鱼鱼肉的预处理:将洗净、去骨和皮的带鱼鱼肉按照固液比1 g:2 mL ~3mL放入缓冲液中,用高速组织捣碎机将其处理成匀浆,然后按照体积比1:3~ 5mL放入乙醚中脱脂

4 ~ 6 h,4 ℃、5000 ~ 6000 rpm,15 ~ 20 min离心除去乙醚,沉淀物冷冻干燥即为脱脂带鱼鱼肉;

按照料液比1g:20~25 mL向脱脂带鱼鱼肉中加入磷酸盐缓冲液(0.02 mol/L,pH 6.5),4

按照脱脂带鱼鱼肉质量的1.5~2.5%向溶液中加入木瓜蛋白酶(酶活力≥2.0×10 U/g),于温度55~65℃下酶解4~6 h后,将溶液升温至90 ℃~ 95℃,并于此温度保持10~15min后,冷却至室温;用NaOH调溶液pH到7.5~8.5,按照蛋白质量的1.5 ~2.0%向溶液中加入胰蛋

4

白酶(酶活力≥2.5×10 U/g),于温度35~45℃下酶解3~4 h,得酶解产物;

3)带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽的制备:将制备的带鱼鱼肉蛋白酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3 kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液按照体积比加入到装有10~15倍AB-8大孔树脂的层析柱中,用3~5倍柱体积水洗脱除去杂质,然后用5~

8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱,乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物,多肽混合物依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,得到带鱼鱼肉蛋白铁螯合肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述步骤1)中的中的带鱼为日本带鱼(Trichiurus japonicus)。

4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述步骤3)的凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为:凝胶柱层析:将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为25~30 mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶LH-20柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高铁螯合活性的峰为凝胶层析酶解物;

RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化,根据对铁的螯合活性得1个高铁螯合活性肽Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met。

5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于所述RP-HPLC条件为:进样量为10~15 μL;色谱柱Kromasil C18 为250 mm×4.6 mm,5 μm;流动相为20%乙腈;洗脱速度0.8~1.0 mL/min;紫外检测波长220 nm。

6.权利要求1所述的一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽用于制备补铁药物和保健品中的用途。