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专利号: 2014105482195
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条,其特征在于:包括聚氯乙烯PVC背衬(1),聚氯乙烯PVC背衬(1)前端设置样品垫(2),样品垫(2)通过结合垫(3)与硝酸纤维素膜(4)前端连接,硝酸纤维素膜(4)后端与吸水垫(5)连接;

所述结合垫(3)上含有胶体金标记的单克隆抗体;硝酸纤维素膜(4)上包被有氯霉素琥珀酸钠-BSA检测线T线(6)和羊抗鼠IgG控制线C线(7);

氯霉素琥珀酸钠-BSA是用于检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的抗原,检测线与质控线平行。

2.权利要求1中所述的试纸条所用的胶体金标记能同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的制备,其特征在于:以甲砜霉素的类似物即1-(4-氨基苯基)-2-二氯乙胺-1,3-丙二醇TAP-NH2作为半抗原,采用重氮化法将其与牛血清蛋白BSA偶联得到免疫原,混合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠;

取合格的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞sp/20融合,经过三次亚克隆和间接竞争ELISA的筛选得到能稳定分泌可同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的细胞株,将其进行扩大培养后,注射到小鼠体内诱发产生腹水;采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水即得到单克隆抗体。

3.权利要求1所述检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条的制备方法,其特征在于步骤为:(1)同时识别甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的单克隆抗体的制备与纯化:如权利要求2所述;

(2)检测抗原氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物的制备:将氯霉素琥珀酸钠与水溶性碳二亚胺EDC以摩尔比1︰3溶于0.1mol/L、pH 6.5的2-(N-吗啡啉)MES缓冲溶液中,室温活化6h,之后将活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.01mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液PBS中,牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸钠的摩尔比为1︰40,室温反应12h,4℃透析3天,形成氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物;

(3)胶体金溶液的制备:用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20-40nm胶体金颗粒;

(4)该单抗标记的胶体金溶液的制备:取步骤(3)制备的4mL胶体金调至pH 9.0,搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.1mg/mL的单克隆抗体0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使终浓度为1%,放置至少30min后,10000r/min离心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸盐缓冲液4mL重悬两次,最后用该硼酸盐缓冲液0.4mL重悬,得到稳定的单克隆抗体-胶体金标记物;

(5)小鼠血清-胶体金标记物的制备:将步骤(4)中的受体替换为阴性小鼠的纯化血清,重复步骤(4),得到小鼠血清-胶体金标记物;

(6)硝酸纤维素膜的处理:将氯霉素琥珀酸钠-BSA偶联物和羊抗鼠IgG分别包被在作为反应垫的硝酸纤维素膜的检测线T线和控制线C线,在37℃烘箱干燥;即得到包被后的硝酸纤维素膜;

(7)三合一试纸条的组装:将样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)由一端依次黏附在PVC背衬(1)上,即得到用于检测的免疫层析试纸条。

4.根据权利要求1所述的检测甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一胶体金免疫层析试纸条,其特征在于其对甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素的最低检测限分别是1ng/mL,2.5ng/mL,1ng/mL。