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专利号: 2013100501833
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2023-08-24
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种酶法快速定量检测heparosan的方法,所述方法包括:

(1)取待测样品,溶于pH7.0~7.5的缓冲液中配制成样品溶液,混匀,25~35℃下平衡0.1~10min,加入足量Heparinase III酶,混匀,20~35℃水浴0.1~3h,加入HCl溶液,离心混匀,取上清液进行紫外分光光光度计检测,以未进行酶反应的样品为空白对照,读出样品的吸光度值A235nm;所述酶体系测定heparosan含量的样本溶液中heparosan的含量为1.6g/L-10g/L,加入的酶量大于8.25U/μL;

(2)配制梯度浓度的heparosan标准品溶液,按照步骤(1)方法进行反应和检测,绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线;

(3)对照标准曲线,根据样品吸光度值A235nm,获得样品溶液中heparosan浓度值,换算得到样品中heparosan含量。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)缓冲液组成如下:Tris HCl 10~

50mM,NaCl 40~80mM,CaCl2 1~4mM,牛血清蛋白0.005~0.02%,溶剂为水,pH 7.0~

7.5。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述方法如下:

(1)取待测样品,溶于缓冲液A中配制成样品浓度1~500g/L的样品溶液,取0.6mL样品溶液,混匀,25~35℃下平衡0.1~10min,加入Heparinase III酶液0.05mL,混匀,25~

35℃水浴0.5~3h,加入50mM HCl溶液2.35mL,离心混匀,取上清液进行紫外分光光光度计检测,以未进行酶反应的样品为空白对照,读出样品的吸光度值A235nm;所述缓冲液A组成如下:Tris HCl 20mM,NaCl 50mM,CaCl2 4mM,牛血清蛋白0.01%,溶剂为水,pH 7.5;所述Heparinase III酶液由Heparinase III酶溶于缓冲液A制得,酶液单位酶活大于165U/mL;

(2)配制梯度浓度在0.1~10g/L之间的heparosan标准品溶液,按照步骤(1)方法进行反应和检测,绘制吸光度值与底物浓度的标准曲线;

(3)对照标准曲线,根据样品吸光度值A235nm,获得样品溶液中heparosan浓度值,换算得到样品中heparosan含量。